嗅觉系统作为模型来研究轴突生长的模式和形态<em>在体内</em

注：动物的处理和实验进行批准的哥廷根大学委员会，伦理动物实验。 1.准备的仪器和吸管制作确保电穿孔装置由具有大的工作距离在立体显微镜的，并配备了荧光照明和过滤套用于所使用的染料。 电穿孔使用一个专用的单个细胞电穿孔仪或附连到示波器的通用方波脉冲发生器。连接所述电穿孔仪输出到移液管保持器和一个浴电极。脉冲发生器的正极端子连接到微管保持器和所述负极端子向浴电极。确保两个吸管保持器和浴电极含有涂有一层薄薄的氯化银的银导线。 安装在显微吸管持有人允许精确定位。 </li> 从制造硼硅玻璃毛细管内的灯丝电微量。 使用水平微量拉马和所描述的贝斯曼等人 13施加改性协议移液器用于膜片钳实验的制造。 适应参数，以产生一个较长的刀柄和一个较小的喷嘴开口导致约15-20兆欧姆的单细胞电穿孔较高的吸液管电阻。移液管电阻要低， 例如 ，3-4兆欧，对细胞群体的标签。 测量可以直接在吸液管电阻与一个专用的单细胞电穿孔仪或测定用应用程序定义的电压脉冲的后示波器电流流动后用欧姆定律计算出来。 2.制备电穿孔的解决方案溶于青蛙铃声（98毫米氯化钠，2毫米氯化钾荧光基团偶联葡聚糖，1毫米氯化钙2,2毫米MGC升2，5mM葡萄糖，5mM的丙酮酸钠，10mM的HEPES，pH调至7.8，克分子渗透压浓度为230 mOsmol /升）以3毫摩尔的浓度存在。这些细胞可能不那么明亮，如果较低的染料浓度使用标记。准备大量库存解决方案，并把它分成小等份。冻结，储存（稳定数月）。 注：葡聚糖是在不同尺寸和各种发射/激发光谱可用的（ 例如 ，页面488葡聚糖10KD，Alexa的546葡聚糖10KD，Alexa的568葡聚糖10KD，Alexa的594葡聚糖10KD，TMR-葡聚糖3KD。）。 回填具有细长枪头用小体积的葡聚糖溶液（1-5微升）微量。仔细轻弹微量用手指从枪头去除残留的气泡。 装在吸管架微量。确保吸液管内的银线是在与染料溶液接触。 3.选择幼虫X的蟾</ EM> 使用X的白化幼虫蟾用于实验。野生型动物中具有该显示期间共焦/多光子成像的自发荧光发射，并且因此不适合用于所描述的实验，颜料填充的黑素细胞。 舞台新科普和法贝尔14后premetamorphotic蝌蚪。选择阶段45-53的实验蝌蚪。 4.电穿孔荧光基团偶联葡聚糖放置一小块组织培养皿中并覆盖它具有小体积的含0.02％三卡因水（3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，调节至pH 7）。 麻醉在水中含0.02％三卡因的蝌蚪。几分钟后，这些动物停止移动。通过触摸蝌蚪确定适当的麻醉。它们应是无响应。 小心地从麻醉转移蝌蚪的组织覆盖的培养皿。 确保洗浴ELECTR颂关闭电电路。确保电极与湿纸巾接触;直接接触到蝌蚪是没有必要的。 定位枪头接近使用显微嗅觉器官。 穿透皮肤覆盖的嗅觉器官与枪头和尖小心翼翼地提前进入主嗅上皮，或犁鼻上皮的位于市中心的感觉神经元层。 引发正极的方形电压脉冲，以染料转移到的感觉神经元。应用单一电压脉冲（ 如 ，25 V，脉冲长度为25毫秒）或多个脉冲序列（ 例如 ，50 V，脉冲宽度300微秒，400毫秒的火车时间在200赫兹）。 注：确定最佳的电压脉冲参数所需的扩展标签。减小电压脉冲的幅度，持续时间和重复次数，以降低标记的细胞的数目。适用于高电压脉冲的幅度，对期限和数量ulses为更广泛的标签。 可视化成功的染料挤压和电利用体视显微镜的荧光照明触发脉冲。成功的电穿孔后的染料迅速扩散到胞体和树突。 重复步骤4.5-4.9的蝌蚪的第二个嗅觉器官。 转移蝌蚪放入盛有淡水回收的烧杯中。经过约5分钟蝌蚪从麻醉中醒来，并开始正常的游泳动作。 后24小时，将电穿孔的染料扩散，在感觉神经元中，并最终到达经由轴突运输嗅球。 5.安装动物体内可视化细胞及轴突的过程麻醉在水中含0.02％三卡因的蝌蚪。 仔细蝌蚪转移到成像室， 比如一个小的硅橡胶盖培养皿蝌蚪大小的凹陷。</ LI> 切一个小矩形变成封口膜的条纹。盖上封口膜的蝌蚪，离开前端脑通过切口窗口暴露出来。修正了上盘针的封口膜，而不伤及蝌蚪。 确保蝌蚪被淹没在含有0.02％三卡因足够的水。 安装成像室上直立多光子显微镜或共聚焦显微镜的阶段。 获得嗅球的图像的三维堆叠。确保该成像程序是尽可能地短，并且不超过10-15分钟。 返回蝌蚪变成正常的水在一个单独的油箱，并防止暴露在光线下。 5分钟后，蝌蚪从麻醉中醒来。 每天指定的时间间隔后，重复步骤5.1-5.7， 如：，。 6.安装动物的细胞和轴突的进程离体可视化另外第5该协议的，使用切除大脑准备可视化标记的感觉神经元。 麻醉，杀死蝌蚪由大脑的横断处过渡到脊髓。切除组织含有嗅觉器官，嗅神经和端脑前一个块。 转移的组织块以蛙振铃溶液和除去结缔组织与细剪至脑的腹侧边露出。 转移组织块的成像室，并与铂框架弦用尼龙线固定。 装入成像室上的共焦/多光子显微镜的阶段。 获得嗅球的图像的三维堆叠。 7.图像处理和数据评估优化，并应用滤波以提高图像质量和神经元结构的可视化的非本地装置所描述的双门轿跑车，P。等人 15。 注：数据来自于活标本更深的组织层成像实验往往是嘈杂。 创建图像栈概述的最大强度的预测。 时间推移成像实验筛选数据集的感觉神经元的单明确标识轴突。 所描述的鹏等人通过神经元突起的软件辅助重建跟踪细胞形态。16。