Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren<em> In Vivo</em

HINWEIS: Animal Handling und Experimente wurden durchgeführt, wie durch die Universität Göttingen Kommission für Ethik in Tierversuchen bestätigt. 1. Herstellung der Instrumente und Pipette Fabrication Stellen Sie sicher, dass die Elektroporation Setup besteht aus einem Stereomikroskop mit großen Arbeitsabstand und mit Fluoreszenzbeleuchtung und Filtersätze für das verwendete Farbstoff ausgestattet. Zur Elektroporation verwenden entweder eine dedizierte Einzelzelle Elektroporator oder eine generische Rechteckimpulsgenerator an ein Oszilloskop angeschlossen. Schließen Sie die Elektroporator Ausgänge in einen Pipettenhalter und einem Bad Elektrode. Den Pluspol des Impulsgenerators an die Mikropipette Halter und dem negativen Anschluß zu dem Bad Elektrode. Sorgen sowohl der Pipettenhalter und die Badelektrode enthalten Silberdrähte mit einer dünnen Schicht von Silberchlorid überzogen ist. Montieren Sie den Pipettenhalter auf einem Mikromanipulator zur exakten Positionierung ermöglichen. </li> Fabrizieren Elektroporation Mikropipetten aus Borosilikatglas Kapillaren mit Innen Filament. Verwenden eine horizontale Pipettenziehvorrichtung und Anwendung einer modifizierten Protokoll für die Herstellung von Pipetten für Patch-Clamp-Experimente wie Bestman et al. 13 beschrieben. Parameter anzupassen, um einen längeren Schaft und einen kleineren Spitzenöffnung, was zu einer höheren Pipettenwiderstand von ca. 15-20 MOhm für Einzelzelle Elektroporation herzustellen. Die Pipettenwiderstand niedriger sein sollte, beispielsweise, 3-4 MOhm, zur Beschriftung von Gruppen von Zellen. Messung der Pipettenwiderstand entweder direkt mit einer eigenen Einzelzell -Elektroporator oder berechnen sie mit dem Ohmschen Gesetz nach Messen des Stromflusses mit einem Oszilloskop nach dem Anlegen eines Spannungsimpulses definiert. 2. Herstellung der Lösung Electroporation Löse Fluorophor-gekoppelten Dextran in Frosch Rufton (98 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM CaCl 2, 2 mM MgCll 2, 5 mM Glucose, 5 mM Na-Pyruvat, 10 mM HEPES, pH 7,8 eingestellt, Osmolarität betrug 230 mOsmol / l) bei einer Konzentration von 3 mM. Die Zellen können nicht so hell markierten niedrigeren Farbstoffkonzentrationen verwendet werden. Bereiten Sie ein großes Volumen Stammlösung und teilen sie in kleine Aliquots. Frieren Sie sie für die Lagerung (über Monate stabil). HINWEIS: Dextrane sind in verschiedenen Größen und einer Vielzahl von Emissions / Anregungsspektren (zB Alexa 488-Dextran 10kD, Alexa 546-Dextran 10kD, Alexa 568-Dextran 10kD, Alexa 594-Dextran 10kD, TMR-Dextran 3 kD liegen.). Verfüllung der Mikropipette mit einem langgestreckten Pipettenspitze mit einem kleinen Volumen von Dextran-Lösung (1-5 ul). Sorgfältig Fingern an die Mikropipette mit dem Finger, um Restluftblasen aus der Pipettenspitze zu entfernen. Montieren Sie die Mikropipette in der Pipettenhalter. Stellen Sie sicher, dass der Silberdraht in der Pipette ist in Kontakt mit der Farbstofflösung. 3. Auswahl der Larven X. laevis </ Em> Verwenden Albino Larven von X. laevis für die Experimente. Wildtyp-Tiere besitzen Pigment gefüllten Melanophoren, die Autofluoreszenzemission während konfokalen / Multiphotonen-Bildgebung zeigen und daher nicht geeignet für den beschriebenen Experimenten. Inszenieren premetamorphotic Kaulquappen nach Nieuwkoop und Faber 14. Wählen Kaulquappen der Stufen 45-53 für die Experimente. 4. Elektroporation von Fluorophor-gekoppelten Dextrane Legen Sie ein kleines Stück Gewebe in einer Petrischale und decken Sie es mit einer kleinen Menge Wasser, das 0,02% Tricaine (Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat, auf pH 7 eingestellt). Anesthetize die Kaulquappen im Wasser, das 0,02% Tricaine. Nach einigen Minuten werden die Tiere nicht mehr bewegt. Überprüfen Sie die Narkose durch Berühren Kaulquappen. Sie sollten nicht reagiert werden. Die Kaulquappe aus der Narkose vorsichtig in das Gewebe abgedeckt Petrischale. Stellen Sie sicher, das Bad elektrOde schließt die Elektroporation Kreis. Sicherzustellen, dass die Elektrode in Kontakt mit dem Feuchttuch; ein direkter Kontakt mit der Kaulquappe ist nicht erforderlich. Positionieren Sie den Mikropipettenspitze in der Nähe des Riechorgan mit Hilfe der Mikromanipulator. Durchdringen die Haut, welche die Riechorgan mit der Pipettenspitze und vorsichtig voran die Spitze in der zentral gelegenen sensorischen Neuronenschicht des Haupt Riechepithel oder vomeronasalen Epithel. Auslösen positive quadratische Spannungsimpulse an Farbstoff in sensorischen Neuronen übertragen. Anwendung einer einzigen Spannungspuls (z. B. 25 V, Impulslänge 25 msec) oder Zügen von mehreren Impulsen (z. B. 50 V, Pulslänge von 300 & mgr; s, 400 ms Folgedauer bei 200 Hz). HINWEIS: Bestimmen Sie die optimale Spannungspulsparameter für den gewünschten Umfang der Kennzeichnung. Spannung verringern Impulsamplitude, Dauer und Anzahl der Wiederholungen, die Zahl der markierten Zellen zu senken. Anwendung höherer Spannung die Impulsamplitude, Dauer und Anzahl von pulses für eine breitere Markierung. Visualisieren erfolgreiche Farbstoff Extrusion und Elektroporation von ausgelösten Impulse mit Fluoreszenzbeleuchtung des Stereomikroskops. Der Farbstoff breitet sich schnell in Zellkörper und Dendriten nach erfolgreicher Elektroporation. Wiederholen Sie die Schritte 4,5-4,9 für den zweiten Riechorgan der Kaulquappe. Übertragen Sie die Kaulquappe in einen Becher mit frischem Wasser für die Wiederherstellung gefüllt. Nach ca. 5 min die Kaulquappen aufwachen aus der Narkose und starten normalen Schwimmbewegungen. Nach 24 Stunden das elektroporierte Farbstoff Spreads in den sensorischen Neuronen und erreicht den Riechkolben über axonalen Transport schließlich. 5. Montage Tiere für die in vivo Visualisierung von Zellen und Nervenbahnen steuert Prozesse Anesthetize die Kaulquappen im Wasser, das 0,02% Tricaine. Sorgfältig übertragen Kaulquappen in eine Abbildungskammer, zB, überdachte ein kleines Silikongummi Petrischale mit einer Kaulquappe großen Aussparung. </ Li> Schneiden Sie ein kleines Rechteck in einem Streifen Parafilm. Decken Sie die Kaulquappe mit dem Parafilm, so dass die vordere Telenzephalon durch die ausgeschnittenen Fenster belichtet. Befestigen Sie den Parafilm mit Nadeln auf dem Teller ohne Verletzung der Kaulquappe. Achten Sie darauf, die Kaulquappe wird in ausreichend Wasser mit 0,02% Tricaine getaucht. Montieren Sie den Imaging-Kammer auf der Bühne eines aufrechten Multiphotonen-Mikroskop oder konfokalen Mikroskop. Erwerben eines dreidimensionalen Stapel von Bildern des Riechkolbens. Sicherzustellen, dass das Bildgebungsverfahren ist so kurz wie möglich und ist 10-15 min nicht überschreiten. Liefert die Kaulquappe in normales Wasser in einem separaten Tank und verhindern, dass im Licht. Nach 5 min, wacht die Kaulquappe aus der Narkose. Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.7 nach bestimmten Zeitabständen, z. B. täglich. 6. Montage Tiere für die ex vivo Visualisierung von Zellen und Nervenbahnen steuert Prozesse Alternativ zu Abschnitt 5des Protokolls, verwenden Sie ein ausgeschnitten Gehirn Vorbereitung, um die markierten sensorischen Neuronen zu visualisieren. Anesthetize und töten die Kaulquappe durch Durchtrennung des Gehirns am Übergang zum Rückenmark. Auszuschneiden einen Block von Gewebe, das die Geruchsorgane, die Geruchsnerven und die vordere Telenzephalon. Übertragen Sie die Gewebeblock zu Froschringerlösung und entfernen Bindegewebe mit einer feinen Schere, um die Bauchseite des Gehirns aus. Übertragen Sie die Gewebeblock zu einer Abbildungskammer und befestigen Sie sie mit einem Platin-Rahmen mit Nylonfäden bespannt. Montieren Sie den Imaging-Kammer auf der Bühne eines konfokalen / Multiphotonen-Mikroskop. Erwerben eines dreidimensionalen Stapel von Bildern des Riechkolbens. 7. Bildverarbeitung und Datenauswertung Optimieren und anzuwenden, nicht lokale mittels Filterung, um die Bildqualität und die Visualisierung von neuronalen Strukturen zu verbessern, wie durch Coupé, P. et al. 15. HINWEIS: Die Daten aus bildgebenden Experimenten in tieferen Gewebeschichten lebender Exemplare sind oft laut. Erstellen maximale Intensität Projektionen der Bildstapel für einen Überblick. Für Zeitraffer Bildschirm Imaging Experimente Datensätze für Einzel eindeutig identifizierbar Axone der sensorischen Neuronen. Rekonstruktion der Zellmorphologie über softwaregestützte Ablaufverfolgung von neuronalen Prozessen von Peng et al. 16 beschrieben.