Summary

Fare dopaminerjik nöronlar İlköğretim Kültür

Published: September 08, 2014
doi:

Summary

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson’s disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Abstract

Dopaminerjik nöronlar, beyindeki sinir hücrelerinin toplam sayısının en az% 1 temsil etmektedir. Nöronların Bu düşük miktarı, motor kontrolü, motivasyon ve çalışma belleği gibi önemli beyin fonksiyonlarını düzenler. Nigrostriatal dopaminerjik nöronlar selektif Parkinson hastalığı (PH) dejenere. Bu ilerleyici nöron kaybı tümden patolojinin motorlar semptomları (bradikinezi, dinlenme tremor ve kas sertliği) ile ilişkili. Dopaminerjik nöron dejenerasyonu sorumlu ana ajan hala bilinmemektedir. Bununla birlikte, bu nöronlar çeşitli koşullarda çok hassas olduğu görülmektedir. Primer kültürler özellikleri ve dopaminerjik nöronların özelliklerini araştırmak için en uygun modellerden birini oluşturmaktadır. Bu kültürler durdurmak ya nöronal dejenerasyonu yavaşlatmak amacıyla PD patolojiyi taklit çeşitli stres ajanları ve nöroprotektif bileşiklere sunulabilir. Jeneratör olmuştur PH çok sayıda transgenik fare modellerison on yılda ated başka dopaminerjik nöron kültürler için araştırmacıların ilgisini artırmıştır. Burada, video protokol embriyonik fare beyinleri hassas diseksiyon üzerinde duruluyor. Ventral mezensefalon hassas eksizyonu Daha sonraki çalışmalar, izin vermek için yeteri kadar dopaminerjik hücrelerin nöronal zengin kültürler elde etmek için önemlidir. Bu protokol, embriyonik transgenik fareler ile gerçekleştirilir ve immünofloresan boyama, nicel PCR, ikinci haberci miktarının ya da nöronal ölüm / hayatta kalma değerlendirme için uygundur edilebilir.

Introduction

Dopamin, temel beyin nörotransmitter 1,2 biri, esas olarak orta beyin dopaminerjik (DA) nöronlar tarafından serbest bırakılır. DA nöronlarının çoğunluğu mezensefalon 2-6 ventral kısmında bulunur. Mesostriatal, mezolimbik ve mezokortikal yollar 2,5 şematik olarak, orta beyin DA nöronlar anatomik ve fonksiyonel üç ayrı projeksiyon sistemleri ayrılabilir. Prefrontal korteks projelendirme dopaminerjik yollar biliş 2 karıştığı oysa nigrostriyatal yolu, mezolimbik yollar takviyesi, motivasyon ve öğrenme önemli bir rol oynar, motor davranışları yer almaktadır.

DA nöronlar örneğin, şizofreni, dikkat eksikliği, hiper aktivite bozukluğu, ve Parkinson hastalığı (PD) 2,4 gibi bazı insan nörolojik hastalıklarda rol oynamaktadır. PD substantia nigra bağlantı DA nöronlarının bir ilerici ve seçici dejenerasyonu ile karakterizedirstriatum pars compacta (SNc). PD motor semptomların sorumlu striatum şiddetli dopamin tükenmesine nigro-striatal DA nöronlar sonuçlarının kaybı (bradikinezi, dinlenme tremor ve rijidite) 7. Idiyopatik PH başlangıç ​​nedeni kanıtlanmamıştır ve güncel tedaviler striatum dopamin seviyesini yeniden amaçlayan, sadece semptomatik vardır. En reçete ilaç, L-dopa (levodopa), dopamin doğal öncüsüdür. Levodopa yönetimi belirli bir süre için dopamin kaybı telafi rağmen, motor komplikasyonlar sonra (üzerine diskinezi ve / kapalı devletler) uzun süreli tedaviler 8,9 oluşur.

Dopaminerjik nöronlar ve PH ilgili araştırma sürekli ilerlemesi ve yoğun çabalar hücre nakli, gen tedavisi veya nöroprotektif ajanların 10,11 dayalı tedaviler geliştirmek için yapılıyor. Ancak, büyük bir sorun olmayan aydınlatılamamıştır kalır: aşırı vulnerab nedeni nedirDA nöronların lü k? Cevap kısmı DA nöron aktivitesi bulunabilir. Elektriksel aktivitesinde ve DA, nöronların uyarılabilirliğinin bir azalma 12 dejenere için eğilimlerini artırmak gibi görünüyor. Bununla birlikte, PD patojenezin karmaşıklığı DA katılan mekanizmaları nöronlar 13-15 dejenerasyonu tespit için ileri çalışmalara gerek.

Primer kültürler DA nöron özelliklerini 16-19 incelemek ve nöroprotektif ajanların 20-24 değerlendirilmesi için çeşitli streslere bu nöronların meydan özellikle alakalı. Sıçan kültürü modeli, genellikle fare embriyo mezensefalon ayrılmasının daha kolay olduğu için, fare ile karşılaştırıldığında, nöronların ve daha yüksek miktarlar da Fare içinde elde edilebilir kullanılır. Ancak, hastalığın 25 transgenik fare modelleri nesil fare 26-29 primer kültürler için nörolog toplumun ilgi artmıştır ölçüde etti. Pr kültürlerin rağmenyeni doğmuş hayvanların epared bu nöronların ayırt etme kapasitelerini muhafaza zaman, mitotik sonrası aşaması (mezensefalon nöronlar için E 13.5) embriyo bunları hazırlamak için daha da kullanılabilir. Aşağıdaki protokol hazırlamak için en zor olan fare embriyoları (E 13.5), birincil kültürde izole mezensefalon nöronlar sunar. Özellikle, daha iyi bir yeniden üretilebilirlik için, serum içermeyen kültür ortamı kullanılarak bir protokol sağlar. Kültür hazırlama (diseksiyon ve mekanik ayrışma) olarak iki en kritik adımlar dikkatle ilişkili videoda detaylı olarak açıklanacaktır.

Protocol

Bu çalışmada kullanılan farenin bakım ve Avrupa Birliği Konseyi kurallarına laboratuvar hayvanlarının kullanımı için (86/609 / AB) uyarınca ele alınmıştır. Gerekli Çözümleri 1. Hazırlık Hazır Çözümler 10x Poli-L-Ornitin (PLO) Çözüm: PLO hidrobromid 10 mg tartılır (molekül ağırlığı = 30,000-70,000) doldurulmuş ve steril, 70 ml su içinde çözülür. -20 ° C de 0.2 um şırınga filtresi, kısım kullanılarak çözeltisi ve mağaza F…

Representative Results

Mezensefalon kültür adımların bir akış şeması gösterilmektedir, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Kısaca, bir gebe fare E 13.5 İsviçre embriyolar alındıktan sonra, ventral mezensefalon tüm embriyo parçalanmıştır. Izole beyin parçaları arka arkaya enzimatik sindirim ve mekanik ayrılma sunulur. Ayrılan hücreler, önceden kaplanmış 12 ya da 24 oyuklu plakalar üzerinde kültür ortamı içinde yeniden süspansiyona alınmış ve kaplama, santrifüj ile pelet haline getirildi. Hü…

Discussion

Bu protokol, embriyonik fare ve dopaminerjik nöronlar tespit etmek için immünofloresan prosedürden mezensefalik nöronlar primer kültürü hazırlamak için gerekli prosedürler ve reaktif maddeler sunmaktadır. Prosedürün kritik aşamaları embriyoların diseksiyon ve toplanan beyin parçalarının mekanik ayrışma bulunmaktadır. Yüksek kaliteli diseksiyon aletleri diseksiyon tekniği master yardımcı olur. DA nöronlar mezensefalonun küçük bir kısmını oluşturmaktadır. Bu duruma göre, ventral mezens…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Supported by grants from CNRS and INSERM. PM acknowledges support from the Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC acknowledges support from the Fondation de France.

Materials

Fetal Bovine Serum Lonza 14-801F
DMEM 4.5g/L Glucose with L-Glutamine Lonza BE12-604F
0.05% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red  Life Technologies 25300-054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Life Technologies 15140122
L-glutamine, 200 mM Solution Life Technologies 25030123
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich  D8537
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Sigma-Aldrich  D0547 Powder
Laminin – 1 mg/mL in Tris buffered NaCl Sigma-Aldrich  L2020
Poly-L-Ornithine hydrobromide Sigma-Aldrich  P3655
Insulin from porcine pancreas Sigma-Aldrich  I5523
apo-Transferrin human Sigma-Aldrich  T1147
Putrescine dihydrochloride Sigma-Aldrich  P5780
Progesterone Sigma-Aldrich  P8783
Sodium selenite Sigma-Aldrich  S5261
HEPES Sigma-Aldrich  H4034 
Glycine Sigma-Aldrich  G7126 Stock solution 1M in water
Gelatin Sigma-Aldrich  G9391 Stock solution 2% (w/v) in water
Triton X-100 Sigma-Aldrich  T8532
Paraformaldehyde 16% in water Electron Microscopy Sciences RT 15710-S
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) Merck Millipore 106329
D(+)-Glucose, Monohydrate Merck Millipore 4074-2
Hydrochloric acid – c(HCl) = 1 mol/l (1 N) Titripur Merck Millipore 109057
Sterile water – Aqua B. Braun Braun
Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent VWR 20821.321
Sterile Petri Dishes VWR 82050-566
Pasteur pipettes plain glass – Wilhem Ulbrich GdbR. VWR 612-2297
Counting chamber Malassez VWR 631-0975
Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm PALL Life science 4525
Surgical Scissors – Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long Fine Science Tools 14002-14 To open the abdominal wall
Scissors – Straight, pointed, delicate, 10 cm long MORIA 4877A To open the uterine wall
Forceps – Curved, usual, serrated jaws 1 mm MORIA 2183 To manipulate embryos
Vannas Scissors – Curved, pointed, 7 mm blades MORIA MC50 To take out the mesencephalon
Ultra Fine Forceps – Curved, delicate, 13 cm long MORIA 9987 To remove meninges
BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates BD Bioscience 356414
BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid BD Bioscience 353043
SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º MENZEL-GLÄSER AG00008032E
Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø MARIENFELD 117580
Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody Chemicon Millipore AB5622 1/200
Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 Chemicon Millipore MAB5406 1/400
Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt  Chemicon Millipore MAB369 1/500
Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody 1/8,000 – Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch)
Goat Serum, New Zealand Origin Life Technologies 16210-064
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Life Technologies A-31556 1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life Technologies A-11001 1/1000
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody Life Technologies A-11007 1/1000
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium Vector Laboratories H-1400
Stereomicroscope Carl Zeiss microscopy Stemi-2000C
Bunsen Burner FIREBOY VWR 451-0136

Referências

  1. Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
  2. Iversen, S. D., Iversen, L. L. Dopamine: 50 years in perspective. Trends Neurosci. 30, 188-193 (2007).
  3. Dahlstroem, A., Fuxe, K. Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons. Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).
  4. Chinta, S. J., Andersen, J. K. Dopaminergic neurons. Int J Biochem Cell Biol. 37, 942-946 (2005).
  5. Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
  6. Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O’Keeffe, G. W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol. 379, 123-138 (2013).
  7. Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R. Parkinson’s disease. Lancet. 363, 1783-1793 (2004).
  8. Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson’s disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal. 2, (2009).
  9. Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain. 134, 2339-2357 (2011).
  10. Obeso, J. A., et al. Missing pieces in the Parkinson’s disease puzzle. Nat Med. 16, 653-661 (2010).
  11. Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson’s disease. Sci Transl Med. 4, (2012).
  12. Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease. FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).
  13. Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. , (2013).
  14. Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. e. r. k. e. r. i. a. n. -. Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson’s disease. J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).
  15. Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S. Pathogenesis of Parkinson’s disease. Mov Disord. 28, 24-30 (2013).
  16. di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions. Nature. 288, 370-373 (1980).
  17. Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones. Nature. 307, 641-643 (1984).
  18. Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).
  19. Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation. J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).
  20. Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels. J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).
  21. Toulorge, D., et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2. FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).
  22. Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis. Mol Pharmacol. 84, (2013).
  23. Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression. PLoS One. 8 (e62040), (2013).
  24. Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).
  25. Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).
  26. Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson’s disease. FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).
  27. Lin, X., et al. Conditional expression of Parkinson’s disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).
  28. Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice. Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).
  29. Ramonet, D., et al. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One. 6 (e18568), (2011).
  30. Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. Dopaminergic axon guidance: which makes what. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
  31. Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).
  32. Ferri, A. L., et al. Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner. Development. 134, 2761-2769 (2007).
  33. Rayport, S., et al. Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology. J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).
  34. Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry. Neurociência. 78, 759-769 (1997).
  35. Nefzger, C. M., et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).
  36. Su, H., et al. Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).

Play Video

Citar este artigo
Gaven, F., Marin, P., Claeysen, S. Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons. J. Vis. Exp. (91), e51751, doi:10.3791/51751 (2014).

View Video