Cultura primária de neurônios dopaminérgicos mouse
Summary
Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson’s disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.
Abstract
Neurónios dopaminérgicos representam menos de 1% do número total de neurónios no cérebro. Esta baixa quantidade de neurônios regula funções importantes do cérebro, como controle motor, motivação e memória de trabalho. Neurônios dopaminérgicos nigrostriatal degenerar seletivamente na doença de Parkinson (DP). Esta perda neuronal progressiva é inequivocamente associado aos motores sintomas da patologia (bradicinesia, tremor de repouso, rigidez muscular e). O principal agente responsável dos neurônios dopaminérgicos degeneração ainda é desconhecida. No entanto, esses neurônios parecem ser extremamente vulneráveis em diversas condições. As culturas primárias constitui um dos modelos mais relevantes para investigar as propriedades e características de neurónios dopaminérgicos. Estas culturas podem ser submetidos a vários agentes estressores que imitam PD patologia e compostos neuroprotetores, a fim de parar ou abrandar a degeneração neuronal. Os inúmeros modelos de camundongos transgênicos do PD que foram generciados durante a última década aumentou ainda mais o interesse dos pesquisadores para as culturas de neurónios dopaminérgicos. Aqui, o protocolo de vídeo concentra-se na dissecação delicada de cérebros embrionárias de rato. Excisão precisa do mesencéfalo ventral é crucial para obter culturas neuronais suficientemente ricos em células dopaminérgicas para permitir estudos posteriores. Este protocolo pode ser realizado com camundongos transgênicos embrionárias e é adequado para imunofluorescência, PCR quantitativo, segundo quantificação mensageiro, ou avaliação morte / sobrevivência neuronal.
Introduction
A dopamina, um dos neurotransmissores cerebrais essenciais 1,2, é libertada principalmente por dopaminérgicos do mesencéfalo (AD) neurónios. A maioria dos neurónios DA residir na parte ventral do mesencéfalo 2-6. Esquematicamente, neurônios DA mesencéfalo podem ser divididos em três sistemas distintos de projeção anatômica e funcionalmente: mesostriatal, mesolímbico, e caminhos mesocorticais 2,5. A via nigroestriatal está envolvida no comportamento do motor, as vias mesolímbica desempenhar um papel importante no reforço, a motivação, aprendizagem e, ao passo que as vias dopaminérgicas que se projectam para o córtex pré-frontal estão implicados na cognição 2.
Neurônios DA estão envolvidos em diversas doenças neurológicas humanas, como a esquizofrenia, déficit de atenção, transtorno de hiperatividade, e doença de Parkinson (DP) de 2,4. A DP é caracterizada por uma degeneração progressiva e selectiva dos neurónios DA ligar substantia nigrapars compacta (SNC) para o estriado. A perda de Nigro-estriatal da neurônios resulta na depleção de dopamina no corpo estriado grave que é responsável de os sintomas motores da DP (bradicinesia, tremor de repouso, rigidez e) 7. A causa inicial da DP idiopática não foi estabelecida e os tratamentos atuais são apenas sintomático, com o objetivo de restaurar o nível de dopamina no corpo estriado. A droga mais prescrita é L-Dopa (Levodopa), o precursor natural da dopamina. Embora a administração de Levodopa compensa a perda de dopamina por um certo tempo, complicações motoras ocorrer após tratamentos de longa duração (discinesia e liga / desliga estados) 8,9.
Pesquisa sobre neurônios dopaminérgicos e PD está em progressão constante e estão sendo feitos intensos esforços para desenvolver tratamentos baseados em transplante de células, a terapia gênica, ou agentes neuroprotetores 10,11. No entanto, um grande problema permanece não elucidado: o que é a causa da extrema vulnerability de neurônios DA? Parte da resposta pode ser encontrada na actividade dos neurónios DA. A redução da atividade elétrica e da excitabilidade dos neurônios de DA parece aumentar sua propensão a se degenerar 12. No entanto, a complexidade do PD patogênese requer mais estudos para identificar os mecanismos envolvidos na degeneração de neurônios DA 13-15.
As culturas primárias são especialmente relevantes para estudar propriedades DA neurônio 16-19 e desafiar esses neurônios para várias tensões para avaliação de agentes neuroprotetores 20-24. Modelos de rato de cultura são os mais frequentemente utilizados, como a dissecação do mesencéfalo de embriões de rato é mais fácil, em comparação com o rato, e maiores quantidades de neurónios podem ser obtidos na ratazana. No entanto, a geração de modelos transgênicos da doença 25 aumentou consideravelmente o interesse da comunidade neurocientista para culturas primárias do rato 26-29. Embora a cultura da prepared de animais recém-nascidos podem ser utilizados, é preferível prepará-los a partir de embriões na fase de pós-mitótico (E13.5 mesencéfalo de neurónios), quando os neurónios mantiveram a sua capacidade de se diferenciar. O protocolo a seguir apresenta os neurónios do mesencéfalo isoladas em cultura primária a partir de embriões de rato (E13.5), as quais são as mais difíceis de preparar. Nomeadamente, é proporcionado um protocolo utilizando meio de cultura isento de soro para uma melhor reprodutibilidade. As duas etapas mais críticas na preparação cultura (dissecção e dissociação mecânica) será cuidadosamente detalhado no vídeo associado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo apresenta os procedimentos e reagentes necessários para a preparação de uma cultura primária de neurónios do mesencéfalo do rato embrionário e o procedimento para a detecção de imunofluorescência neurónios dopaminérgicos. As etapas críticas do processo são a dissecção dos embriões ea dissociação mecânica dos fragmentos cerebrais coletados. Instrumentos de dissecção de alta qualidade ajuda a dominar a técnica de dissecação. Neurónios DA constituem uma pequena percentagem do mesenc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by grants from CNRS and INSERM. PM acknowledges support from the Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC acknowledges support from the Fondation de France.
Materials
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| DMEM 4.5g/L Glucose with L-Glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-glutamine, 200 mM Solution | Life Technologies | 25030123 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D0547 | Powder |
| Laminin – 1 mg/mL in Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-Ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| apo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Stock solution 1M in water |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Stock solution 2% (w/v) in water |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyde 16% in water | Electron Microscopy Sciences | RT 15710-S | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-Glucose, Monohydrate | Merck Millipore | 4074-2 | |
| Hydrochloric acid – c(HCl) = 1 mol/l (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| Sterile water – Aqua B. Braun | Braun | ||
| Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent | VWR | 20821.321 | |
| Sterile Petri Dishes | VWR | 82050-566 | |
| Pasteur pipettes plain glass – Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| Counting chamber Malassez | VWR | 631-0975 | |
| Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
| Surgical Scissors – Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long | Fine Science Tools | 14002-14 | To open the abdominal wall |
| Scissors – Straight, pointed, delicate, 10 cm long | MORIA | 4877A | To open the uterine wall |
| Forceps – Curved, usual, serrated jaws 1 mm | MORIA | 2183 | To manipulate embryos |
| Vannas Scissors – Curved, pointed, 7 mm blades | MORIA | MC50 | To take out the mesencephalon |
| Ultra Fine Forceps – Curved, delicate, 13 cm long | MORIA | 9987 | To remove meninges |
| BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD Bioscience | 353043 | |
| SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º | MENZEL-GLÄSER | AG00008032E | |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø | MARIENFELD | 117580 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody | 1/8,000 – Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| Goat Serum, New Zealand Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1000 |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss microscopy | Stemi-2000C | |
| Bunsen Burner FIREBOY | VWR | 451-0136 |
Referências
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