Wij een reproduceerbare werkwijze voor type 1 diabetes (T1D) bij de muis binnen twee weken adoptieve overdracht van eilandjescellen antigeen-specifieke primaire CD4 + T-cellen.
De nonobese diabetische (NOD) muis ontwikkelt spontaan auto-immune diabetes na 12 weken oud en is de meest uitgebreid bestudeerde diermodel voor menselijke type 1 diabetes (T1D). Celoverdracht studies in bestraalde ontvanger muizen hebben aangetoond dat T-cellen zijn cruciaal bij T1D pathogenese in dit model. We beschrijven hier een eenvoudige methode om snel induceren T1D door adoptieve overdracht van gezuiverde primaire CD4 + T-cellen van pre-diabetische NOD muizen transgeen voor het eilandje T cel receptor (TCR) BDC2.5 in NOD.scid ontvangende muizen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat isolatie en adoptieve overdracht van diabetogene T-cellen kan worden voltooid binnen dezelfde dag, wordt bestraling van de ontvangers niet vereist, en een hoge incidentie van type 1 wordt opgewekt binnen 2 weken na de T-cel-overdracht. Aldus kan studies pathogenese en therapeutische interventies bij T1D plaatsvinden bij een hogere snelheid dan bij werkwijzen die berusten op heterogene T cel populaties of klonenafgeleid van diabetische NOD muizen.
De NOD muis ontwikkelt auto-immune diabetes spontaan en is op grote schaal gebruikt als diermodel voor menselijke T1D 1,2. Pathogenese van type 1 in NOD muizen gekenmerkt door infiltratie, beginnend op 3-4 weken oud, van de pancreatische eilandjes van Langerhans door dendritische cellen en macrofagen, gevolgd door T-en B-cellen. Deze fase van niet-destructieve peri-insulitis leidt tot een langzame, progressieve vernietiging van insuline-producerende pancreatische β cellen, resulterend manifeste diabetes wordt 4-6 maanden 3. Overdracht van splenocyten 4,5, 6,7 of CD4 + CD8 + T-cellen van 8,9 diabetische NOD muizen is aangetoond dat diabetes bemiddelen in immuungecompromitteerde NOD muizen, wat aangeeft dat eilandje-reactieve T-cellen spelen een centrale rol in T1D pathogenese. Afhankelijk van de experimentele omstandigheden, diabetes ontwikkeld in ontvangende muizen langzaam gedurende een aantal weken in deze studies. Ook verschillende T cel klonen, verkregen door tijdrovende en durekweken van diabetogene T-cellen, is gemeld diabetes mediëren enkele weken na overdracht ontvangende muizen 7,10. Met de beschikbaarheid van transgene muizen die TCR afgeleid van CD4-of CD8-diabetogenic beperkte T-celklonen, verschillende laboratoria hebben aangetoond dat vervolgens milt T-cellen van dergelijke muizen konden diabetes dragen aan ontvangers 11-13. Specifiek, BDC2.5 NOD muizen transgeen voor BDC2.5 TCR, die specifiek is voor chromogranine A, een eiwit in pancreatische bètacellen 14-16. Overdracht van in vitro-geactiveerde of niet-geactiveerde geheel of gefractioneerde miltcellen van openlijk diabetes of prediabetes BDC2.5 muizen overgebracht diabetes te neonatale of immunodeficiënte NOD muizen op verschillende efficiëntie 11,17-19.
We beschrijven een eenvoudige methode die gezuiverd transgene CD4 + T-cellen maakt gebruik van pre-diabetische BDC2.5 muizen te induceren T1D in de ontvangende muizen op een hoog rendement en consistentie. Grote aantallen naïeve eilandje antigeen-specifieke CD4 + T-cellen geïsoleerd uit deze muizen door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) voor CD4 + CD62L + T cellen die het transgene TCR Vβ4 keten. Gezuiverd transgene T-cellen worden vervolgens overgedragen zonder activering in NOD.scid muizen, die functioneel T en B cellen missen en zijn insulitis-en diabetes-vrij 20. De ontvangende muizen worden gecontroleerd op verhoogde concentraties van urine glucose aangegeven T1D die snel ontwikkelt zich binnen twee weken na T celoverdracht.
In tegenstelling tot andere methoden overdragen diabetogenic T-cellen met heterogene specificiteiten ons protocol gebruikt FACS-gesorteerd CD4 + T-cellen die bijna uitsluitend de expressie diabetogenic BDC2.5 TCR. Door hun homogeniteit, slechts kleine aantallen overgedragen T-cellen (~ 1×10 6 cellen / muis) nodig voor een snelle ontwikkeling T1D binnen 2 weken 100% incidentie. Een ander voordeel van ons protocol is dat DOORSTRALI GSIn van ontvangende muizen is niet nodig omdat voor een aantal andere methoden. Een mogelijke beperking van deze methode is dat het niet het onderzoek naar de bijdrage van zowel CD4 en CD8 T-cel subsets of specifieke CD8 T-cellen in diabetes mogelijk.
De beschreven protocol handig voor het bestuderen T1D snelle ontwikkeling, gemedieerd door naïeve, mono-specifiek CD4 + T-cellen, alsook therapeutische strategieën voor interventie in homing van eilandjescellen antigeenspecifieke Th cellen het doelwitorgaan worden.
T1D kan worden geïnduceerd in ontvangende muizen met verschillende efficiëntie van adoptieve overdracht van gehele miltcellen of T-cel subsets van diabetische NOD muizen of muizen die transgeen zijn voor TCR afgeleid van diabetogenic T-celklonen. Wij rapporteren hier een reproduceerbare werkwijze voor het induceren T1D in ontvangende muizen binnen twee weken bij 100% incidentie van overdracht FACS-gezuiverde CD62L + BDC2.5 transgene CD4 + T cellen in NOD.scid-muizen.
Specifieke voordelen v…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Drs. Robert Bonneau en Neil Christensen voor nuttig commentaar.
Dit werk werd ondersteund door de Pennsylvania State University College of Medicine fondsen.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
Sterile surgical tweezers | |||
Sterile small pair scissors | |||
Sterile large pair scissors | |||
70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
Phase contrast microscope | |||
Trypan blue | |||
Hemocytometer | |||
Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
Heat lamp | |||
Mouse restrainer | |||
1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |