Мы предоставляем воспроизводимый метод, чтобы вызвать сахарный диабет 1 типа (СД-1) у мышей в течение двух недель от приемных передачи островок антиген-специфические, первичные CD4 + Т-клеток.
Без ожирения диабетические (NOD) мышей спонтанно развивается аутоиммунный диабет после 12-недельного возраста и является наиболее широко изучены животную модель человеческого диабета 1 типа (СД-1). Сотовые передачи исследований в облученных мышей получатель будет установлено, что Т-клетки играют ключевую роль в патогенезе СД-1 в этой модели. Мы описываем здесь простой способ быстро индуцируют T1D приемными передача очищенной, первичные CD4 + Т-клеток из предварительно диабетической NOD трансгенных мышей для островка-специфических Т-клеточный рецептор (TCR) BDC2.5 в NOD.SCID мышей получателя. Основные преимущества этого метода в том, что изоляция и приемных передачи диабетогенные Т-клеток может быть завершена в течение одного дня, облучение получателей не требуется, и высокая частота T1D поведения возникает в течение 2 недель после переноса Т-клеток. Таким образом, исследования патогенеза и терапевтических вмешательств при СД1 может протекать с большей скоростью, чем с методами, которые полагаются на гетерогенные популяции Т-клеток или клоны, полученных из диабетических мышей NOD.
NOD мышей развивается аутоиммунный диабет спонтанно и широко используется в качестве животной модели для человеческого СД-1 1,2. Патогенез СД-1 в NOD мышей характеризуется инфильтрацией, начиная с 3-4 недель, в панкреатических островках Лангерганса дендритными клетками и макрофагами, после чего Т-и В-клеток. Эта фаза неразрушающего пригородных инсулитом приводит к медленному, прогрессирующим разрушением инсулин-продуцирующие клетки поджелудочной железы β, в результате чего явным диабетом в 4-6 месячном возрасте 3. Передача спленоцитов 4,5, 6,7 CD4 + или CD8 + 8,9 Т-клеток от диабетических мышей NOD было показано, что промежуточный диабета у мышей NOD с ослабленным иммунитетом, указывая, что островок-реактивные Т-клетки играют центральную роль в патогенезе СД-1. В зависимости от условий эксперимента, диабет разработаны в мышей-реципиентов медленно, в течение нескольких недель в этих исследованиях. Кроме того, различные клоны Т-клеток, полученных трудоемким и дорогостоящимкультивирование диабетогенные Т-клеток, как сообщается, посредником диабета через несколько недель после перевода на мышей-реципиентов 7,10. При наличии трансгенных мышей, экспрессирующих TCR, полученных из CD4-CD8 или ограничением диабетогенные клонов Т-клеток, несколько лабораторий впоследствии показали, что Т-клетки селезенки от таких мышей были в состоянии передавать диабетом получателям 11-13. В частности, BDC2.5 мышей NOD являются трансгенными для BDC2.5 TCR, которая является специфической для хромогранином, белка в бета-клетки поджелудочной железы 14-16. Передача в пробирке активированный или ООН-активированной полностью или фракционированного клетки селезенки открыто диабетическая или преддиабетом BDC2.5 мышей передаются диабет новорожденных или иммунодефицитных мышей NOD с разной эффективностью 11,17-19.
Опишем простой метод, который использует очищенную трансгенных CD4 + Т-клеток от преддиабетическом BDC2.5 мышей, чтобы вызвать T1D в мышей-реципиентов при высокой эффективности и consisteNCY. Большие количества наивных, островок антиген-специфических CD4 + Т-клетки выделяют из этих мышей с активацией флуоресценции сортировки клеток (FACS) для CD4 + CD62L + Т-клеток, экспрессирующих TCR трансгенных Vβ4 цепи. Очищенный трансгенных Т-клетки, которые затем передаются без активации в NOD.SCID мышей, у которых отсутствует функциональный Т-и В-клеток и инсулитом и диабет без 20. Мышей-реципиентов контролируются на повышенных концентраций глюкозы в моче указывает T1D, которая быстро развивается в течение двух недель после перевода T клетки.
В отличие от других методов, которые передают диабетогенные Т-клеток с гетерогенной особенностей, наш протокол использует FACS отсортированные CD4 + Т-клеток, которые почти исключительно выразить диабетогенные BDC2.5 TCR. Благодаря своей однородности, только небольшое количество Т-клеток передается (~ 1×10 6 клеток / мышь) необходимы для быстрого развития СД-1 в течение 2 недель в 100% случаев. Еще одно преимущество нашего протокола является то, что irradiatioп мышей-реципиентов не является необходимым, так и для некоторых других методов. Потенциальным ограничением этого метода является то, что она не позволяет расследование вклад как CD4 и CD8 Т-клетки или подмножества специально CD8 Т-клеток при диабете.
Описанный протокол будет полезна для изучения быстрых T1D развитие, опосредовано наивный, моноспецифическую CD4 + Т-клеток, а также терапевтических стратегий вмешиваться в самонаведения островковых антиген-специфические клетки Th к органу-мишени.
СД-1 может быть индуцирован в мышей-реципиентов с различной эффективностью по приемных передачи целых клеток селезенки или Т-клетки из подмножества диабетических мышей NOD или трансгенных мышей для TCR, полученный из сахарного диабета клеточных клонов Т. Мы сообщаем здесь воспроизводимы…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим д-ра. Роберт Бонно и Нил Кристенсен за полезные комментарии.
Эта работа выполнена при поддержке Университета штата Пенсильвания Медицинского колледжа средств.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
Sterile surgical tweezers | |||
Sterile small pair scissors | |||
Sterile large pair scissors | |||
70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
Phase contrast microscope | |||
Trypan blue | |||
Hemocytometer | |||
Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
Heat lamp | |||
Mouse restrainer | |||
1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |