我们提供了一个可重复的方法,诱导1型糖尿病(T1D)在小鼠胰岛抗原特异性的,初级的CD4 + T细胞过继转移在两个星期内。
非肥胖糖尿病(NOD)小鼠自发地开发自身免疫性糖尿病12周龄后,是最广泛研究的动物模型,人类1型糖尿病(1型糖尿病)。照射的受体小鼠的细胞转移的研究已经建立了1型糖尿病的发病机制在这个模型中,T细胞的关键。我们描述一个简单的方法迅速诱发T1D继转移纯化,小学的CD4 + T细胞前糖尿病NOD小鼠胰岛特定的T细胞受体(TCR)BDC2.5到NOD.SCID受体小鼠的转基因。这种技术的主要优点是可以在同一天,不要求收件人照射型糖尿病的发病率很高,引起T细胞转移后2周内完成隔离和致糖尿病性T细胞过继转移。因此,研究可以继续以更快的速度比I型糖尿病的发病机理和治疗干预的方法依赖于异质性T细胞群或克隆来自糖尿病NOD小鼠。
NOD小鼠自发地开发自身免疫性糖尿病,并已被广泛用作人I型糖尿病的动物模型1,2。 I型糖尿病NOD小鼠的发病机制中的浸润,其特征在于,开始在3-4周的年龄,胰腺胰岛的树突状细胞和巨噬细胞,T细胞和B细胞。这一阶段的非破坏性的周边胰岛炎导致一个缓慢的,逐渐产生胰岛素的胰腺β细胞的破坏,从而导致明显的糖尿病,由4-6个月3岁。已转让4,5脾细胞,CD4 + 6,7或CD8 + 8,9糖尿病NOD小鼠T细胞介导糖尿病NOD小鼠免疫功能低下,表明胰岛反应性T细胞在1型糖尿病的发病机制中发挥了核心作用。根据不同的实验条件下,糖尿病受体小鼠发展缓慢,在几个星期内,在这些研究中。同样,来自不同的T细胞克隆,费时和昂贵的致糖尿病性T细胞的培养,已报告的几个星期后,转移到受体小鼠7,10介导糖尿病。随着转基因小鼠表达的TCR来自CD4或CD8限制的致糖尿病的T细胞克隆,一些实验室的可用性,其后已表明,从小鼠脾脏T细胞能够转移糖尿病收件人11-13。具体来说,NOD小鼠BDC2.5只转基因BDC2.5 TCR,这是具体 的嗜铬粒蛋白A,胰腺β细胞中的一种蛋白质14-16。 在体外激活或者未激活的全部或分馏公然糖尿病或糖尿病前期BDC2.5糖尿病小鼠转移到新生儿或免疫缺陷的NOD小鼠在不同的效率11,17-19脾细 胞的转移。
我们描述了一个简单的方法,利用纯化的转基因的CD4 + T细胞在高效率和consiste的受体小鼠诱导T1D从糖尿病前期BDC2.5小鼠NCY。从这些小鼠中分离大量的幼稚,胰岛抗原特异性CD4 + T细胞通过荧光激活细胞分类(FACS),CD4 + CD62L + T细胞表达的转基因TCRVβ4的链。纯化的转基因T细胞,然后转移无需激活到NOD.SCID的老鼠,缺乏功能性T细胞和B细胞和胰岛炎和糖尿病无20。受体小鼠进行监测尿糖浓度升高,表明I型糖尿病,迅速发展后两周内的T细胞转移。
相比之下致糖尿病异构特异性T细胞转移的其他方法,我们的协议,使用流式细胞仪排序CD4 + T细胞,几乎完全表达的致糖尿病BDC2.5的TCR。由于他们的同质性,只有少数转移T细胞(约1×10 6个细胞/鼠标)T1D发展迅速,需要2个星期内,在100%的发病率。我们的协议的另一个优势是,irradiation的受体小鼠是没有必要的,因为它是为一些其他的方法。这种方法的一个潜在的局限性,它并没有允许调查,CD4和CD8 + T细胞亚群,或特别是CD8 + T细胞在糖尿病的贡献。
所描述的协议将是有用的研究的T1D的快速发展,介导的幼稚的,单特异性CD4 + T细胞,以及治疗策略干预胰岛抗原特异性的Th细胞的归巢至靶器官。
1型糖尿病可以诱发受体小鼠的整个糖尿病NOD小鼠或来自致糖尿病性T细胞克隆的TCR转基因小鼠的脾细胞或T细胞亚群的过继转移在不同的效率。我们在此报告可重复的方法,在两周内100%的发病率在受体小鼠诱发T1D通过流式细胞仪纯化CD62L + BDC2.5转基因的CD4 + T细胞的转移到NOD.SCID小鼠。
这里所描述的特定优势的BDC2.5 T细胞传输模型,包括诱导时间很短,相比T1D月自发糖尿病和糖…
The authors have nothing to disclose.
我们感谢博士。罗伯特BONNEAU和尼尔·克里斯滕森有益的意见。
这项工作是由美国宾夕法尼亚州立大学医学院的资金支持。
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
Sterile surgical tweezers | |||
Sterile small pair scissors | |||
Sterile large pair scissors | |||
70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
Phase contrast microscope | |||
Trypan blue | |||
Hemocytometer | |||
Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
Heat lamp | |||
Mouse restrainer | |||
1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |