Diabetogenic CD4의 입양 전송하여 마우스의 가속 제 1 형 당뇨병 유도 + T 세포
Summary
우리는 섬 항원 특정 기본 CD4 + T 세포의 입양 전송하여 두 주 이내에 생쥐에서 제 1 형 당뇨병 (T1D)를 유도하는 재생 방법을 제공합니다.
Abstract
nonobese 당뇨병 (NOD) 마우스 자발적 연령 12 주 후에 면역 당뇨병을 개발하고 인간 1 형 당뇨병 (T1D)의 가장 광범위하게 연구 동물 모델입니다. 조사받는 생쥐의 세포 이동 연구는 T 세포가이 모델 T1D 발병에 중요한 것을 설립했다. 우리는 빠르게 정화의 입양 전송에 T1D 유도하기 위해 여기에 간단한 방법을 설명, 기본 CD4 + NOD.SCID받는 생쥐에 섬 특정 T 세포 수용체 (TCR) BDC2.5위한 형질 전환 전 당뇨병 NOD 생쥐에서 T 세포. 이 기술의 주요 장점은 같은 일 이내에, 수신자의 조사가 필요하지 않으며 T1D의 높은 발병률이 T 세포 전송 후 2 주 안에 이끌어됩니다 diabetogenic T 세포의 분리 및 입양 전송이 완료 될 수 있습니다. 따라서, T1D의 병인과 치료 개입의 연구는 이종 T 세포 집단 또는 복제에 의존하는 방법으로보다 빠른 속도로 진행할 수 있습니다당뇨병 NOD 생쥐에서 파생.
Introduction
NOD 마우스는 자발적으로자가 면역 당뇨병을 개발하고 널리 인간의 T1D 1,2에 대한 동물 모델로 사용되었습니다. NOD 생쥐에서 T1D의 발병 기전은 T와 B 세포에 의해 다음 수지상 세포와 대 식세포에 의한 랑게르한스의 췌장의, 나이, 3-4 주에 시작 침윤이 특징입니다. 비파괴 요정 인슐린 염이 단계는 3 세 ~ 6 개월 명백한 당뇨병의 결과로 인슐린 생산 췌장 β 세포의 느린 진보적 인 파괴에 이르게한다. 4,5 비장 세포, CD4 + 당뇨병 NOD 생쥐에서 6,7 또는 CD8 + 8,9 T 세포의 이동은 섬 반응 T 세포가 T1D 병인에 중요한 역할을한다는 것을 나타내는 면역 NOD 생쥐에서 당뇨병을 중재하기 위해 표시되었습니다. 실험 조건에 따라 당뇨병이 연구의 여러 주에 걸쳐 서서히받는 생쥐에서 개발했습니다. 마찬가지로, 다양한 T 세포 클론은 시간과 비용에 의해 파생diabetogenic T 세포의 배양은 몇 주받는 마우스 7,10로 전송 한 후 당뇨병을 중재하는 것으로보고되었다. CD4 또는 CD8 제한된 diabetogenic T 세포 클론, 여러 실험실에서 파생하는 TCR 표현 형질 전환 생쥐의 가용성이어서는 마우스에서 비장 T 세포가 11-13 사람에게 당뇨병을 전송 할 수 있었던 것으로 나타났습니다. 특히, BDC2.5 NOD 마우스는 chromogranin A, 췌장 베타 세포 14-16에서 단백질 특정 BDC2.5 TCR에 대한 형질 전환합니다. 체외 활성화 또는 효율성에게 11,17-19 다양한에서 신생아 나 면역 결핍 NOD 마우스로 당뇨병을 전송 공공연히 당뇨병 또는 prediabetic BDC2.5 생쥐 해제 활성화 또는 전부를 분별 비장 세포에서의 전송합니다.
우리는 정제 된 형질 전환 CD4를 사용하는 간단한 방법 + 높은 효율과 consiste에서받는 생쥐에서 T1D 유도하는 사전 당뇨병 BDC2.5 생쥐에서 T 세포를 설명NCY. 순진, 섬 항원 특이 CD4 + T 세포의 큰 숫자는 CD4에 대한 형광 활성 세포 정렬 (FACS) 형질 전환 TCR Vβ4 체인을 표현 + CD62L + T 세포에 의해 이러한 생쥐에서 격리됩니다. 정제 된 유전자 변형 T 세포는 그 기능 T 및 B 세포의 부족과 인슐린 염 및 당뇨병 무료 20아르 NOD.SCID 마우스로 작동하지 않는 전송됩니다. 받는 마우스는 T 세포 전송 후 2 주 이내에 신속하게 개발 T1D를 나타내는 소변 포도당의 높은 농도를 모니터링합니다.
이종 특이성과 diabetogenic T 세포를 전송, 우리의 프로토콜은 FACS 정렬 된 CD4 + 거의 독점적으로 diabetogenic BDC2.5 TCR을 표현하는 T 세포를 사용하는 다른 방법과 달리. 자신의 동질성으로 인해, 전송 T 세포 (~ 1X10 6 세포 / 마우스) 만 작은 숫자가 100 % 발생에서 2 주 안에 신속하게 T1D 개발을 위해 필요합니다. 우리의 프로토콜의 또 다른 장점은 irradiatio입니다받는 생쥐의 N은 다른 방법입니다 필요하지 않습니다. 이 방법의 잠재적 인 제한은 모두 CD4와 CD8 T 세포의 하위 집합 또는 특정 당뇨병 CD8 T 세포의 공헌에 대해 조사를 허용하지 않는 것입니다.
설명 프로토콜은 대상 기관에 섬 항원 특이 목 세포의 유도에 개입 순진, monospecific CD4 + T 세포뿐만 아니라 치료 전략에 의해 중재 빠른 T1D 개발, 연구에 유용 할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
T1D은 당뇨병 NOD 마우스 또는 diabetogenic T 세포 클론에서 유래 TCR는 형질 전환 생쥐에서 전체 비장 세포 또는 T 세포 부분 집합의 입양 전송하여 효율성을 다양한에서받는 생쥐에서 유도 할 수 있습니다. 우리는 여기 NOD.SCID 생쥐에 FACS – 정제 CD62L + BDC2.5 형질 전환 된 CD4 + T 세포를 전송하여 100 % 발생에서 2 주 이내에받는 생쥐에서 T1D 유도하는 재생 방법을보고합니다.
BDC2.5 T 세?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Drs에 감사드립니다. 도움이 덧글에 대한 로버트 BONNEAU 닐 크리스텐슨.
이 작품은 의학 자금의 펜실베니아 주립 대학에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
| Phase contrast microscope | |||
| Trypan blue | |||
| Hemocytometer | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
Referências
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