Nous fournissons une méthode reproductible pour induire un diabète de type 1 (DT1) chez la souris dans les deux semaines par le transfert adoptif de l'îlot spécifiques de l'antigène, CD4 + primaires des cellules T.
Les diabétiques (NOD) souris non obèses se développe spontanément diabète auto-immun après 12 semaines d'âge et est le modèle le plus largement étudié animal humain de type 1 du diabète (DT1). études sur le transfert des cellules dans des souris receveuses irradiées ont établi que les lymphocytes T jouent un rôle essentiel dans la pathogenèse du DT1 dans ce modèle. Nous décrivons ici une méthode simple pour rapidement induire une DT1 par transfert adoptif de purifié, CD4 + primaires des cellules T de souris NOD pré-diabétiques transgéniques pour le récepteur des cellules T îlot spécifique (TCR) BDC2.5 dans des souris receveuses NOD.SCID. Les principaux avantages de cette technique sont que l'isolement et le transfert adoptif de lymphocytes T diabétogéniques peut être complété dans le même jour, l'irradiation des bénéficiaires n'est pas nécessaire, et une forte incidence de diabète de type 1 est provoqué dans les 2 semaines après le transfert de cellules T. Ainsi, les études sur la pathogenèse et les interventions thérapeutiques dans le DT1 peuvent se réaliser à un rythme plus rapide que les méthodes qui s'appuient sur des populations de cellules T hétérogènes ou des clonesprovenant de souris NOD diabétiques.
La souris NOD développe un diabète auto-immune spontanément et a été largement utilisé comme modèle animal pour 1,2 DT1 humaine. Pathogenèse du DT1 chez les souris NOD est caractérisée par l'infiltration, à partir de 3-4 semaines d'âge, des îlots de Langerhans du pancréas par les cellules dendritiques et les macrophages, suivis par les cellules T et B. Cette phase de non-destructive péri-insulite conduit à une lente destruction progressive des cellules β pancréatiques productrices d'insuline, entraînant un diabète patent de 4-6 mois d'âge de 3 ans. Transfert de splénocytes 4,5, 6,7 ou CD4 + CD8 + 8,9 lymphocytes T de souris NOD diabétiques ont été montrés à la médiation du diabète chez la souris NOD immunodéprimés, ce qui indique que les cellules T îlots réactifs jouent un rôle central dans la pathogenèse du DT1. Selon les conditions expérimentales, le diabète développé dans les souris receveuses lentement, sur plusieurs semaines dans ces études. De même, les différents clones de lymphocytes T, dérivé par le temps et coûteuseculture de cellules T diabétogéniques, ont été signalés à la médiation diabète plusieurs semaines après transfert dans des souris receveuses 7,10. Avec la disponibilité de souris transgéniques exprimant des TCR dérivées de CD4 ou des clones de lymphocytes T CD8 diabétogéniques restriction, plusieurs laboratoires ont ensuite montré que les cellules T spléniques de ces souris ont été en mesure de transférer le diabète aux bénéficiaires 11-13. Plus précisément, BDC2.5 souris NOD sont transgéniques pour le TCR BDC2.5, qui est spécifique de la chromogranine A, une protéine dans les cellules bêta du pancréas 14-16. Le transfert de cellules pt non activées rate entières ou fractionnées de diabétiques ou prédiabétiques ouvertement BDC2.5 souris transférés diabète de souris NOD néonatales ou immunodéficientes à des efficacités variables 11,17-19 vitro activé ou.
Nous décrivons une méthode simple qui utilise CD4 + purifiés transgéniques cellules T de pré-diabétiques BDC2.5 souris pour induire le DT1 dans les souris receveuses à haut rendement et Consistence. Un grand nombre d'îlots de Langerhans, naïfs CD4 + spécifiques d'un antigène des cellules T sont isolés à partir de ces souris par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour CD4 + CD62L + des cellules T exprimant la chaîne TCR transgénique Vβ4. Les cellules T transgéniques purifiés sont ensuite transférés dans des souris sans activation NOD.SCID, qui manquent T fonctionnelles et les lymphocytes B et sont sans diabète insulite et 20. Les souris receveuses sont surveillés pour des concentrations élevées de glucose dans l'urine indiquant DT1, qui se développe rapidement dans les deux semaines après le transfert de cellules T.
Contrairement à d'autres méthodes qui transfèrent des cellules T diabétogéniques avec des spécificités hétérogènes, notre protocole utilise triées par FACS cellules T CD4 + qui expriment presque exclusivement le diabetogenic BDC2.5 TCR. En raison de leur homogénéité, seul un petit nombre de cellules T transférées (~ 1×10 6 cellules / souris) sont nécessaires pour le développement du DT1 rapide dans les 2 semaines à 100% d'incidence. Un autre avantage de notre protocole est que irradiation des souris receveuses n'est pas nécessaire que ce soit pour d'autres méthodes. Une limitation potentielle de cette méthode est qu'elle ne permet pas à l'enquête sur la contribution des deux CD4 et CD8 sous-ensembles de cellules T CD8 ou spécifiquement les lymphocytes T dans le diabète.
Le protocole décrit sera utile pour étudier le développement rapide DT1, médiée par les naïfs CD4 monospécifiques cellules T, ainsi que des stratégies thérapeutiques pour intervenir dans homing des cellules Th spécifiques de l'antigène îlots à l'organe cible.
DT1 peut être induite chez la souris bénéficiaires à des efficacités variables par transfert adoptif de cellules de rate entières ou des sous-ensembles de lymphocytes T de souris NOD diabétiques ou les souris transgéniques pour le TCR provenant de clones de lymphocytes T diabétogéniques. Nous rapportons ici une méthode reproductible pour induire le DT1 dans les souris receveuses dans les deux semaines à 100% d'incidence en transférant FACS purifiés CD62L + BDC2.5 CD4 + lymphocytes T transgéniques dans…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions les Drs. Robert Bonneau et Neil Christensen pour leurs commentaires utiles.
Ce travail a été soutenu par la Pennsylvania State University College de fonds de la médecine.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
Sterile surgical tweezers | |||
Sterile small pair scissors | |||
Sterile large pair scissors | |||
70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
Phase contrast microscope | |||
Trypan blue | |||
Hemocytometer | |||
Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
Heat lamp | |||
Mouse restrainer | |||
1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |