ونحن نقدم طريقة استنساخه للحث على مرض السكري من النوع 1 (T1D) في الفئران خلال أسبوعين من نقل بالتبني من جزيرة مستضد محددة، CD4 + الخلايا التائية الأولية.
مرض السكري (NOD) الماوس nonobese يتطور بشكل عفوي السكري الذاتية بعد 12 أسبوعا من العمر، ودرس على نطاق واسع هو نموذج حيواني معظم نوع الإنسان مرض السكري 1 (T1D). وقد أثبتت الدراسات نقل الخلايا في الفئران المتلقية المشع أن الخلايا T تقوم بدور محوري في التسبب في T1D هذا النموذج. وصفنا هنا طريقة بسيطة لبسرعة تحفز T1D بواسطة نقل بالتبني من المنقى، CD4 + الخلايا التائية الأولية من مرحلة ما قبل السكري الفئران المعدلة وراثيا NOD لمستقبلات الخلايا التائية جزيرة محددة (TCR) BDC2.5 في الفئران المتلقية NOD.SCID. أهم مزايا هذه التقنية هي أن العزلة وبالتبني نقل الخلايا T سكري يمكن أن تكتمل في غضون نفس اليوم، غير مطلوب التشعيع من المتلقين، وأثار وجود نسبة عالية من T1D في غضون 2 أسابيع بعد نقل الخلايا التائية. وبالتالي، يمكن أن دراسات المرضية والتدخلات العلاجية في T1D المضي قدما بوتيرة أسرع من مع الأساليب التي تعتمد على غير متجانسة السكان الخلية T أو استنساخالمستمدة من الفئران NOD السكري.
الماوس NOD يتطور مرض السكري المناعة الذاتية بشكل عفوي، واستخدمت على نطاق واسع باعتبارها نموذج حيواني ل1،2 T1D الإنسان. يتميز التسبب في T1D في الفئران NOD بواسطة تسلل، ابتداء من الساعة 3-4 أسابيع من العمر، من البنكرياس الجزر لانكر بواسطة الخلايا الجذعية والضامة، تليها T والخلايا B. هذه المرحلة من غير مدمرة شبه التهاب الجزر يؤدي إلى بطء والتدمير التدريجي للخلايا المنتجة للأنسولين β البنكرياس، مما يؤدي إلى مرض السكري العلني من قبل 4-6 أشهر من العمر 3. وقد ثبت نقل splenocytes 4،5، CD4 + CD8 + 6،7 أو 8،9 T خلايا من الفئران NOD السكري للتوسط السكري في الفئران المناعة NOD، مشيرا إلى أن الخلايا T جزيرة التفاعلي تلعب دورا محوريا في التسبب T1D. اعتمادا على الظروف التجريبية، وضعت السكري في الفئران المتلقية ببطء، على مدى عدة أسابيع في هذه الدراسات. وبالمثل، ومختلف الحيوانات المستنسخة الخلايا التائية، التي يجنيها تستغرق وقتا طويلا ومكلفازراعة الخلايا T سكري، تم الإبلاغ عن التوسط السكري بعد عدة أسابيع نقل في الفئران المتلقية 7،10. مع توافر الفئران المعدلة وراثيا معربا عن TCRS المستمدة من CD4 أو CD8 المقيدة سكري استنساخ الخلايا التائية، العديد من المختبرات أظهرت لاحقا أن الخلايا T الطحال من هذه الفئران كانت قادرة على نقل مرض السكري إلى المستلمين 11-13. على وجه التحديد، BDC2.5 NOD الفئران المعدلة وراثيا هي لBDC2.5 TCR، والتي هي محددة لكروموغرانين A، وهو بروتين في خلايا بيتا في البنكرياس 14-16. ونقل في المختبر تنشيط أو إلغاء تنشيط كله أو مجزأ خلايا الطحال من السكري بشكل علني أو [برديبتيك BDC2.5 الفئران نقل السكري لحديثي الولادة أو العوز المناعي الفئران NOD في الكفاءة متفاوتة 11،17-19.
نحن تصف طريقة بسيطة التي تستخدم CD4 + الخلايا المعدلة وراثيا تنقية T من مرحلة ما قبل السكري BDC2.5 الفئران للحث على T1D في الفئران المتلقية على كفاءة عالية وconsisteNCY. يتم عزل أعداد كبيرة من السذاجة، جزيرة CD4 مستضد محددة + الخلايا التائية من هذه الفئران عن طريق الفرز مضان تنشيط الخلايا (FACS) لCD4 + + الخلايا التائية CD62L تعبر عن TCR سلسلة Vβ4 المعدلة وراثيا. ثم يتم نقل تنقية الخلايا التائية المعدلة وراثيا دون تفعيل في الفئران NOD.SCID، والتي تفتقر T والخلايا B وظيفية والتهاب الجزر هي والسكري مجانا-20. ويتم رصد الفئران المتلقية لتركيزات مرتفعة من الجلوكوز البول مما يدل T1D، الذي يتطور بسرعة في غضون أسبوعين بعد نقل الخلايا التائية.
وعلى النقيض من الأساليب الأخرى التي نقل خلايا T سكري مع الخصوصيات غير متجانسة، يستخدم بروتوكول لدينا نظام مراقبة الأصول الميدانية فرزها CD4 + الخلايا التائية التي تعبر بشكل حصري تقريبا على سكري BDC2.5 TCR. ونظرا لتماثلها، وسيتطلب الأمر فقط أعداد صغيرة من الخلايا T نقل (~ 1X10 6 خلية / الماوس) لتطوير T1D السريع في غضون اسابيع 2 في الإصابة 100٪. ميزة أخرى لبروتوكول لدينا هو أن irradiatioن من الفئران المتلقية ليست ضرورية كما هو الحال بالنسبة لبعض الطرق الأخرى. وجود قيود المحتملة لهذا الأسلوب هو أنه لا يسمح التحقيق في مساهمة كل من CD4 و CD8 مجموعات فرعية الخلايا التائية CD8 أو على وجه التحديد خلايا T في مرض السكري.
سوف بروتوكول الموصوفة أن تكون مفيدة لدراسة تطوير T1D السريع، بوساطة السذاجة، CD4 + الخلايا التائية أحادي النوعية، فضلا عن الاستراتيجيات العلاجية للتدخل في صاروخ موجه من جزيرة الخلايا ال محددة مستضد إلى الجهاز المستهدف.
يمكن أن يتسبب T1D في الفئران المتلقي في متفاوتة الكفاءة عن طريق التحويل بالتبني من خلايا الطحال كله أو مجموعات فرعية من الخلايا التائية الفئران NOD السكري أو الفئران المعدلة وراثيا لTCRS المستمدة من الحيوانات المستنسخة سكري الخلايا التائية. نفيدكم هنا طريقة استنساخه لل?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر الدكاترة. روبرت بونو ونيل كريستينسن لتعليقات مفيدة.
وأيد هذا العمل من قبل ولاية بنسلفانيا كلية جامعة ولاية الأموال الطب.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
Sterile surgical tweezers | |||
Sterile small pair scissors | |||
Sterile large pair scissors | |||
70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
Phase contrast microscope | |||
Trypan blue | |||
Hemocytometer | |||
Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
Heat lamp | |||
Mouse restrainer | |||
1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |