El esquema general del experimento se muestra en la Figura 1. 1. Animal preparación y traslado al laboratorio del comportamiento En el laboratorio, preparar el comportamiento de configuración: llenar los pozos de las placas de prueba diferentes (ensayos 1 a 3 abajo) con las pastillas, que sirven como recompensa durante las pruebas de comportamiento. Transferir el mono de la sala de alojamiento en grupo en una jaula de transferencia. El mono está capacitado para entrar en un túnel que da acceso a la silla de primates, con la colocación posterior de la cabeza. El peso del mono es medida, antes de la transferencia en la silla de primates en el laboratorio. 2. Prueba 1: Modificado Brinkman bordo Esta prueba, modificado y adaptado a partir de los informes anteriores 4,5, es la tarea básica del comportamiento de referencia, que se realizará en cada sesión de comportamiento. Iniciar la grabación de vídeo con la cámara digital por encima de la puesta en marcha (también posibilidad de colocar 2 adcámaras adicionales, uno a cada lado de la placa) y el lugar del mono en frente de la Junta de Brinkman. Abierta, por ejemplo, la ventana de la derecha en la silla de primates para dar acceso a la mano derecha. Con la mano derecha, el mono recupera los pellets de alimentos a partir de las 50 ranuras (25 verticales y horizontales 25). Tras la finalización de la prueba, cierre la ventana de la derecha y volver a llenar la tarjeta con pellets. Abra la ventana de la izquierda y repita la prueba para la mano izquierda. Recompensar a los animales al final de la prueba con algunas pasas secas o una almendra, un procedimiento que se repite al final de cada prueba para mantener la motivación durante toda la sesión del día. Información adicional: tres cámaras de vídeo digitales se utilizan para registrar la secuencia de procesamiento fuera de línea, colocados uno encima de la mesa y uno a cada lado de la placa (para evaluar con precisión la posición de los dedos mientras se realiza la captación). Dentro de la misma sesión diaria, the mono puede realizar otra tarea (ya sea la tarea 2, y / o las tareas 3 y / o la tarea 4, para ser distribuidos entre los diferentes días de la semana). Para la prueba de 1, si el mono se inició con la mano derecha en el día 1, comienza con la mano izquierda en el día 2 y así sucesivamente. Opcional: Si bien el examen anterior con uno u otro lado por separado permite comparar el rendimiento de la mano izquierda a la derecha (para identificar la "mano dominante"), también es posible en una etapa temprana de la formación para que el mono realizar la tarea con ambas manos simultáneamente. Si una parte se utiliza con más frecuencia que el otro para captar pellets, entonces puede ser considerada como la "mano preferida". 3. Prueba 2: caja de Brinkman (con y sin control visual) La caja de Brinkman comprende 20 pozos (10 horizontal vertical y 10). En comparación con la prueba 1, el mono tiene que controlar la mano en un espacio limitado, con grados de libertad reducida para llevar a cabo la precisióncontrol de movimiento. Llenar el tablero con perdigones y cerca de la faceta superior de la caja, con el fin de llevar a cabo la primera prueba en ausencia de control visual (basándose en la exploración táctil). Coloque el mono en frente de la caja Brinkman. Abra la ventana izquierda de la silla de primates para probar la mano izquierda en ausencia de un control visual. El mono intenta recuperar los 20 pastillas, mientras que la secuencia se graba desde una cámara digital colocada debajo de la caja. Cierre la ventana de la izquierda de la silla de los primates. Vuelva a llenar el tablero con pellets. Abra la ventana de la derecha de la silla de los primates. El mono se repite la prueba con la mano derecha en ausencia de un control visual. Cierre la ventana de la derecha de la silla de los primates. Para poner a prueba la capacidad de captar pellets en el cuadro Brinkman bajo control visual, abra la faceta superior de la caja. Vuelva a llenar la caja con pastillas y el mono realiza la prueba con la mano derecha. Cierre la ventana de la derecha de la silla de los primates. Vuelva a llenar la caja con pastillas. </li> Abra la ventana izquierda de la silla de primates. El mono lleva a cabo la prueba con la izquierda paso hand.Repeat 2.5. 4. Prueba 3: Rotación de Brinkman bordo Esta prueba es comparable a la tarea Brinkman bordo (prueba 1), salvo que la junta está girando, lo que obligó al mono a anticipar el desplazamiento de la placa en un (a la derecha) o la otra dirección (hacia la izquierda). Llenar el tablero con pellets. La secuencia se graba con una cámara digital colocada por encima de la puesta en marcha (también la posibilidad de colocar dos cámaras adicionales, uno a cada lado). Abra la ventana de la derecha de la silla de los primates. El mono recupera los pellets a partir de los 32 pozos, distribuidos en cuatro filas concéntricas, mientras que la placa está girando hacia la derecha. Cierre la ventana de la derecha. Vuelva a llenar el tablero con pellets. Abra la ventana izquierda de la silla de primates. El mono lleva a cabo la prueba como en la 4.2 con la mano izquierda. Repetir los puntos 4.2 a 4.4, mientras que el Consejo Directivo del Is girando hacia la izquierda (una mano detrás de otro). Repita el paso 2.5. 5. Prueba 4: alcanzar y agarrar tarea cajón Para combinar la capacidad de comprensión con la capacidad de generar fuerza, esta prueba (derivado de las anteriores versiones 6-11) fue diseñado para que el mono tiene que abrir un cajón, al ejercer primero una fuerza de agarre en la perilla del cajón, seguido por una carga la fuerza para abrir el cajón, que da acceso a una píldora colocada en el interior del cajón. El pellet se recupera con la misma mano, mientras que el cajón permanece abierto, de nuevo con el agarre de precisión. Una cámara digital se coloca en la parte superior del cajón, para grabar los ensayos para el control off-line de los datos (por ejemplo la detección de los juicios erróneos). Abra la ventana de la derecha de la silla de los primates. El mono lleva a cabo 10 ensayos en cada uno de los 5 niveles diferentes de resistencia, con la mano derecha (que por lo menos 5 ensayos correctos para cada nivel de resistencia). Repita la prueba (50 ensayos) con the izquierda. Repita el paso 2.5. Información adicional: En la próxima sesión diaria de comportamiento, se alternan la mano con la que el animal hizo la primera prueba en la sesión anterior. 6. Fin de la sesión de comportamiento Después de la terminación de los exámenes contemplados en ese día, se alimentan y recompensar a los monos con los alimentos, además de los pellets recibidos durante las pruebas. Por lo general, el mono recibe cereales y frutas. El mono es devuelto a la sala de alojamiento en grupo con los compañeros. La secuencia temporal preciso de las distintas pruebas realizadas que está escrito en la forma de protocolo. 7. Resultados representante Las cuatro pruebas de comportamiento se ilustra arriba (Figura 1) se han utilizado ampliamente en nuestro laboratorio en el contexto de los estudios destinados a la investigación de la recuperación funcional de la lesión de la médula espinal cervical (Figura 2A) o de la corteza motora (Figura 2B), en ausencia o en presencia de un tratamiento para incrementar la recuperación espontánea 12-19. Para la prueba 1 (modificada Brinkman bordo), el análisis se centra en dos parámetros (Figuras 3 y 4 A): i) la calificación dada por el número de pellets recuperado por el mono en los primeros 30 segundos, contados por separado de las ranuras verticales y las ranuras horizontales (mediante la reproducción off-line la secuencia de vídeo grabada), ii) el tiempo de contacto (TC), definido como el tiempo (duración) de contacto entre los dedos y el precipitado (véase también la figura 6, la serie final de imágenes ). Es el intervalo de tiempo entre la inserción del primer dedo (generalmente el dedo índice) en la ranura para tocar el precipitado y el inicio de la recuperación de la bolita del pozo. El intervalo de tiempo se mide mediante la reproducción fotograma a fotograma de la secuencia de vídeo. El CT se mide durante los primeros cinco vérticoranuras y al de los primeros cinco ranuras horizontales dirigidas por el mono 16-18. Los gráficos de la puntuación de ilustrar la fase inicial de formación, la meseta pre-lesión, la dramática caída de la calificación (por lo general a cero) inmediatamente después de la lesión, la progresiva (espontáneo) la recuperación funcional hacia la meseta después de la lesión. La recuperación funcional se expresa en% en la proporción de la media después de la lesión puntuación en la fase estacionaria, dividido por el promedio de pre-lesión puntuación (meseta) * 100 (Figuras 3 y 4A). Para el TC, como un aumento refleja un déficit, la recuperación funcional expresado en% es la proporción de la media antes de la lesión CT (meseta), dividido por la mediana después de la lesión en la meseta de CT * 100. El efecto de los tratamientos post-lesión, demostró sobre la base de la prueba 1, se ilustran en detalle en los informes anteriores de este laboratorio 14,15,17. Un análisis más detallado puede abordar la cuestión de la estrategia, es decir, la secuencia temporal de espacios visitados por el monkey (Figura 4B). Para la prueba 2 (caja de Brinkman), aunque la puntuación también se puede establecer como en la prueba 1, un parámetro más significativo es el "tiempo total", definida como el intervalo de tiempo entre la recolección del sedimento en la primera ranura y la recogida de el precipitado en el último (20 º) ranura (Figura 5). A la recuperación funcional puede ser calculado y expresado en%. Se calcula utilizando la mediana del tiempo total de pre-lesión (meseta después de la fase de formación), dividido por el total de la mediana de tiempo post-lesión en la meseta * 100. Para la prueba 3 (rotación Brinkman bordo), aunque la puntuación también se puede establecer que el anterior (prueba 1), un parámetro sensible es el tiempo de contacto (CT, definido como antes en la prueba 1), medido durante los primeros diez ranuras (Figura 6 ). Para la prueba 4 (. Alcanzar y agarrar tarea cajón), el c set-upomprises varios detectores, grabación de eventos discretos, como el inicio del ensayo (por interrumpe un haz de luz colocado en frente del panel), mano que toca la perilla, el inicio del cajón tirando, al final de la apertura del cajón, la mano en la ranura (pick-en el tiempo ), la retirada de la mano de la ranura (pick-out). Transductores de fuerza en el mando permiten medir la fuerza de agarre (ejercida por el pulgar y el dedo índice presionando el botón) y la fuerza de carga (ejercida para sacar el cajón, para contrarrestar los diferentes niveles de resistencia impuestas a la apertura del cajón). Los diferentes niveles de resistencia se oponen a la apertura del cajón se obtuvieron al cambiar la intensidad de la corriente aplicada a un motor electromagnético rotativo unido a la parte trasera del cajón. La puesta en marcha está diseñado para aplicar una fuerza de resistencia en paralelo a la orientación de la apertura del cajón. Esquema detallado del cajón de set-up está disponible bajo petición al autor correspondiente. Todos estos datos se recogen con la interfaz de unª de software de Spike 2 y muestra como se ilustra en la Figura 7. Como ya se ha reported1 4,15, estas tareas representan la base del comportamiento para investigar si la recuperación espontánea de una lesión de la médula cervical se puede mejorar con un tratamiento específico dirigido a promover la regeneración axonal (Figura 8). La calificación de recuperación y los parámetros de tiempo de contacto reflejar los diferentes componentes de la destreza manual: la primera incluye la secuencia entera del motor (alcanzar y agarrar, la retirada de la mano, el transporte de la pastilla en la boca), mientras que el segundo se centra en la fase de agarre solamente. Estos dos parámetros son particularmente precisos y complementarios para el modificado y las tareas de rotación Brinkman bordo. Mientras que el índice representa la información en gran medida redundante en estas dos tareas, el tiempo de contacto en contraste proporciona información más específica de la tarea debido a lala variabilidad de las posiciones de las ranuras en la tarea de rotación Brinkman bordo, en comparación con su posición estática en la tarea de modificar Brinkman bordo. La tarea caja de Brinkman se diferencia de las dos tareas mencionadas, los grados de libertad de movimientos con la mano están limitados por el espacio cerrado. Como consecuencia, las posiciones de las diferentes ranuras de la placa en la caja de Brinkman juegan un papel importante en términos de dificultad para llevar a cabo la aprehensión manual, debido a lo exiguo de la caja. Por ejemplo, el agarre con la mano de las ranuras situadas en la parte derecha de la caja interfiere con la pared lateral derecha. En consecuencia, la evaluación de los resultados de recuperación limitada a 30 segundos como en el tablero modificado Brinkman sería sesgada en función de la posición de las ranuras en realidad la visita del mono durante este período de tiempo limitado, lo que genera una variabilidad sustancial de una sesión a otra. Por esta razón, es más apropiado para INVOlve todas las franjas horarias (n = 20) y por lo tanto el tiempo total de parámetro elegido. En la tabla modificada Brinkman, el tiempo total no se ha considerado, como el mono, en algunos casos la motivación sueltos (por ejemplo después de la lesión), debido al gran número de ranuras que se realiza (n = 50). En la misma línea, el análisis del tiempo de contacto implicaría tomar todas las ranuras de la caja de Brinkman en cuenta (mientras que sólo los primeros cinco lugares en la tabla modificada Brinkman se considera como la posición de las ranuras seleccionado tiene poca o ninguna impacto sobre este parámetro). Por lo tanto, para la caja de Brinkman, se recomienda en una primera aproximación para determinar el tiempo total, ya que se observó a ser un parámetro muy pertinente y de información, al menos en nuestros estudios con monos sometidos a una lesión de la corteza motora (no hay datos disponibles para la médula espinal lesionada monos). Sin embargo, el tiempo de contacto puede ser considerado para el cuadro de Brinkman, pero en un segundo paso incluyendo las veinte máquinas tragamonedas, sin embargo, por separadopara las ranuras horizontales y verticales (no se muestra). Figura 1. Esquema general del experimento. El animal es trasladado de las instalaciones de animales en la silla de primates, transportados al laboratorio de comportamiento. En cada sesión diaria, el mono realiza la prueba 1. En días alternos, el mono se lleva a cabo la prueba 2, y / o prueba de 3, y / o la prueba 4. Algunos monos (especialmente motivado) pueden realizar todas las pruebas en la misma sesión diaria. Pellets de alimentos (se usa como recompensa) estaban hechas de plátano seco o en polvo de glucosa que se comprime en una forma redonda de unos 4 mm de diámetro. En todas nuestras pruebas de comportamiento, usamos pellets sin polvo de precisión (45 mg) proporciona BioServ, una calle octava, una suite, Frenchtown, NJ 08825, EE.UU.. La dimensión de la junta directiva modificada Brinkman es de 240 mm de largo y 140 mm, mientras que la dimensión de las ranuras es de 15 mm de largo, 8 mm MEDe y 6 mm de profundidad. El diámetro de la junta directiva de la junta rotativa Brinkman es de 114 mm. . Figura 2 Representante (quirúrgica) lesión de la médula cervical (panel A, modificado a partir de 15) y (química) lesión de la corteza motora (panel B, modificado a partir de 16), derivados de las correspondientes secciones histológicas, procesado por SMI-32 tinción . El grado máximo de la lesión de la médula cervical ha sido reconstruido a partir de secciones consecutivas sagital de la médula espinal (panel A), mientras que la extensión y localización de la lesión de la corteza motora ha sido reconstruido a partir de secciones consecutivas frontal del cerebro y volverá a colocar-en un Vista lateral del hemisferio cerebral correspondiente (punto rojo en el panel B). La lesión de la médula cervical el resultado de una sección transversal con una hoja de cirugía a nivel de C7-C8, lo que resulta en una hemisección sub-interrumpir unilateralmente las principales vías CS componentespermanente en el funículo dorsolateral, por encima de las motoneuronas que controlan los músculos mano 14,15,20. La lesión cortical permanente fue producida por la infusión de ácido iboténico 13,16,17, en los sitios que cubren la representación de la mano previamente establecidos con microestimulación intracortical (ICMS, ver 16,21,22). El territorio lesión cortical se presenta como una interrupción brusca de la tinción SMI-32 de las neuronas en las capas III y V en el banco rostral del surco central (zona delimitada con la línea discontinua en el panel B). Figura 3. Representante de datos derivados de la tarea de modificar Brinkman bordo (prueba 1) realizado por un mono sometido a una lesión de la médula espinal (como se ilustra en la Figura 2A). La gráfica muestra la puntuación (ordenada), por separado para las ranuras verticales (símbolos azules) y las ranuras horizontales (símbolos rojos). Los símbolos amarillos son por la suma depuntuaciones verticales y horizontales en un determinado período de sesiones todos los días. En el eje de abscisas, el tiempo es durante los días consecutivos de sesiones de la conducta. La línea roja punteada vertical (día 0) es el día en que se realizó la lesión. Tres diferentes períodos se destacan: el primero (línea discontinua negro) corresponde al periodo de formación, el segundo (línea azul discontinua) a la meseta de rendimiento antes de la lesión, y el tercero (línea verde discontinua) a la meseta de se recuperó el rendimiento. Los datos fueron modificados a partir del 15. Figura 4A. Igual que en la figura 3 (prueba 1), pero en un mono sometido a una lesión de la corteza motora (como se ilustra en la Figura 2B). Los gráficos muestran el resultado (un panel, las mismas convenciones que en la Figura 3) y el tiempo de contacto (CT, panel B) de datos. En el eje de abscisas, el tiempo se paralos días consecutivos de sesiones de la conducta. La línea roja punteada vertical (día 0) es el día en que se realizó la lesión. En el panel B, cada punto corresponde a la época del contacto entre el dedo y el precipitado en una ranura (5 ensayos por la orientación de cada sesión, la barra gris representa el valor de la mediana). Tenga en cuenta que para los ensayos en los que el animal no podía realizar la tarea (inmediatamente después de la lesión), el TC aparece como un valor saturado a 5 segundos. Los datos fueron modificados a partir de 16,17. Figura 4B. Análisis de la estrategia adoptada en la tarea de modificar Brinkman Junta realiza con la mano contralesional, antes de la lesión de la corteza motora (Pre), durante la fase de recuperación (Recovery) y después de la lesión en la meseta (Post). El color de cada ranura indica el orden secuencial de los espacios visitados por el mono en una sesión (la ranura visitó por primera vez se representa en el azul más oscuro y la ranura de la última vez por el más oscuro de color rojo). Nota del that antes de la lesión, el mono comenzó en el lado izquierdo de la placa y escaneado de manera sistemática hacia la derecha. Durante la recuperación, el orden secuencial se ha cambiado. En la meseta después de la lesión, la estrategia adoptada antes de la lesión reapareció (exploración sistemática de izquierda a derecha). Figura 5. Representante de datos derivados de la caja de Brinkman (prueba 2), por un mono de realizar la tarea bajo el control visual. La ordenada es el tiempo total necesario para vaciar los 20 pozos a lo largo de las sesiones diarias (abscisa), llevado a cabo antes y después de una lesión de la corteza motora (línea vertical de trazos). Las dimensiones del volumen accesible dentro de la caja son 1.360 cm 3 (120mm * 110mm * 103mm). Tenga en cuenta una fase inicial de formación, que se caracteriza por una mayor variabilidad del tiempo total de una sesión a otra. Inmediatamente después de la lesión cortical, elmono no era capaz de realizar la tarea (puntos de datos saturado a 200 segundos). El valor p es estadísticamente significativa la diferencia entre la mediana del tiempo total antes de la lesión (en el centro del rectángulo horizontal gris en la parte izquierda) y el tiempo total medio después de la lesión en las últimas sesiones (en el centro del rectángulo horizontal gris a la derecha ). El porcentaje de recuperación funcional es 89,6%, mientras que el volumen de la lesión de la corteza motora fue de 41,8 mm 3. Los datos fueron modificados a partir del 19. Figura 6. Los resultados representativos (dos gráficos superiores) que se derivan de la tarea rotativa Brinkman bordo (prueba 3), con la ilustración del tiempo de contacto medidas pre y post-lesión de la lesión, con las mismas convenciones que en la figura 4A (panel B), por un mono sometido a una lesión de la corteza motora (los datos modificados a partir de 17). El gráfico superior es de un sentido ("CI") ro ción de la junta, mientras que el gráfico inferior es de un reloj ("C-Cl") la rotación de la junta. Las dos flechas grises verticales indican que el tiempo de contacto fue infinitamente largo en pocas sesiones inmediatamente después de la lesión, como el mono era incapaz de realizar la tarea con la mano contralesional. La serie de imágenes en la parte inferior de la figura se ilustra el método para medir el tiempo de contacto (válido tanto para la junta modificada Brinkman y la junta rotatoria Brinkman). La imagen izquierda muestra la mano acerca de la ranura que contiene la pastilla (100 ms antes del contacto entre el dedo índice y el pellet). El siguiente cuadro de la derecha corresponde al punto en el tiempo de contacto (0 ms). Entonces, el tiempo de contacto se define como el intervalo de tiempo (en ms) en funcionamiento hasta llegar al fotograma (derecha uno) correspondiente al punto de tiempo en el que la pastilla se toma fuera de la ranura. El tiempo de contacto aquí es de 240 ms. 58/3258fig7.jpg "/> Figura 7. Representante de datos derivados de una sesión realizada por un mono en el alcance y la tarea de captar cajón (prueba 4). Un panel: La información correspondiente a los tres parámetros adquiridos en línea en un solo ensayo: la fuerza de carga en rojo, la fuerza de agarre en azul y el desplazamiento del cajón en color verde. Varios marcadores también fueron adquiridas durante la tarea: la cosecha del tiempo corresponde al tiempo de la recompensa de agarrar, totalmente abierta a la apertura total del cajón y tocar la perilla (TCH) hasta el punto de tiempo cuando el animal toca por primera vez el mando. Para el análisis, siete cursores fueron colocados en los puntos de tiempo crítico en la tarea de desarrollo (por ejemplo, tres cursores de color gris en la parte inferior tres líneas horizontales): 1) el tiempo encerrado en el toque del mando por parte del animal, 2) la aparición de la fuerza de agarre; 3) la fuerza máxima de agarre, y 4) la aparición de la fuerza de carga, 5) la fuerza de carga máxima; 6) tiempo encerrado en el cajón está totalmente abierta; 7) el tiempo encerrado en el tiempo de recolección. Grupo B: Representación de los resultados cuantitativos por dos parámetros registrados durante la tarea: la fuerza de agarre (fuerza se usa para sujetar el mando entre el dedo índice y el pulgar) y la fuerza de carga (la fuerza utilizada para abrir el cajón) en dos esquemas: el valor máximo (gráfico izquierdo) y el valor de la pendiente (desde el inicio hasta el máximo;. gráfico de la derecha). Cuatro de los cinco niveles diferentes en relación de la resistencia han sido ilustradas aquí: R0 (0 Newton), R3 (1,4 N), R5 (2,75 N) a R7 (5 N). La perilla del cajón tiene una forma triangular y planas. La base del triángulo unido al cajón de las medidas de 20 mm y la parte superior (15 mm de la base), consiste en un contorno circular de 7 mm de diámetro. El propio cajón tiene las siguientes dimensiones: longitud = 50 mm, ancho = 27 mm y la altura = 45 mm. <p class="Jove_content"> Figura 8. Reminder (modificado a partir de 15) de la utilización de la prueba de comportamiento del 1 al investigar el posible efecto de un tratamiento (anti-Nogo-A anticuerpos) en la recuperación funcional de la lesión de la médula cervical. Tanto para las puntuaciones y tiempo de contacto, así como ranura para ambas orientaciones, el grupo de control de anticuerpos monos tratados (símbolos azules, n = 6) se recupera menos destreza manual, así que el grupo de anti-Nogo-A anticuerpos monos tratados (símbolos rojos , n = 7), especialmente para grandes volúmenes de lesión. Los dos grupos difieren significativamente con p = 0.035 (panel A), p = 0.022 (panel B), p = 0,035 (grupo C) y p = 0.008 (panel D).