O esquema geral do experimento é descrito na Figura 1. 1. Preparação de animais e transferência para o laboratório de comportamento No laboratório, preparar o comportamento set-up: encher os poços das placas de teste diferentes (exames 1 a 3) com as pelotas, que servem como recompensa durante os testes comportamentais. Transferência do macaco da sala de alojamento em grupo em uma gaiola de transferência. O macaco é treinado para entrar em um túnel que dá acesso à cadeira de primatas, com o posicionamento posterior da cabeça. Peso do macaco é medido, antes da transferência da cadeira de primata para o laboratório. 2. Teste 1: Modificado Brinkman bordo Este teste, modificados e adaptados a partir de relatórios anteriores 4,5, é a tarefa básica do comportamento de referência, a ser realizado em cada sessão de comportamento. Iniciar a gravação de vídeo com a câmera digital acima do set-up (também possibilidade de colocar dois adcâmeras tradicionais, um de cada lado do tabuleiro) e coloque o macaco na frente do conselho Brinkman. Aberta, por exemplo, a janela da direita na cadeira de primatas para dar acesso para a direita. Usando a mão direita, o macaco recupera os pellets de alimentos a partir do 50 slots (25 vertical e 25 horizontal). Após a conclusão do teste, feche a janela da direita e volte a encher o quadro com pellets. Abra a janela da esquerda e repita o teste para a mão esquerda. Recompensa o animal no final do teste com algumas passas secas ou uma amêndoa, um procedimento a ser repetido no final de cada teste, para manter a motivação durante toda a sessão diária. Informações adicionais: Três câmaras de vídeo digitais são usados para gravar a seqüência de processamento off-line, colocados um acima do bordo e um de cada lado da placa (para avaliar com precisão a posição dos dedos durante a realização do captar). Dentro da mesma sessão diária º,macaco e pode executar outra tarefa (seja a tarefa 2, e / ou tarefa 3 e / ou tarefa 4, para ser distribuído entre os diferentes dias da semana). Para o teste 1, se o macaco começou com a mão direita no dia 1, começam com a mão esquerda no dia 2 e assim por diante. Opcional: Enquanto o teste realizado acima, com um ou outro lado em separado permite comparar o desempenho da mão esquerda para a direita (para identificar a "mão dominante"), também é possível numa fase inicial do treinamento para que o macaco executar a tarefa com ambas as mãos simultaneamente. Se por um lado é usado com mais freqüência do que os outros para compreender pellets, então ele pode ser considerado como a "mão preferida". 3. Teste 2: caixa de Brinkman (com e sem controle visual) A caixa de Brinkman compreende 20 poços (10 horizontal, vertical e 10). Em comparação com um teste, o macaco tem que controlar a mão em um espaço limitado, com graus de liberdade reduzida para executar a precisãomovimento de aderência. Encher a placa com pellets e fechar a faceta superior da caixa, a fim de realizar o primeiro teste na ausência de controle visual (contando com exploração tátil). Coloque o macaco na frente da caixa de Brinkman. Abra a janela do lado esquerdo da cadeira de primatas para testar a mão esquerda na ausência de controle visual. O macaco tenta recuperar os 20 pellets, enquanto a seqüência é gravado a partir de uma câmera digital colocada abaixo da caixa. Feche a janela do lado esquerdo da cadeira de primatas. Encher a placa com pellets. Abra a janela direita da cadeira do primata. O macaco repete o teste com a mão direita na ausência de controle visual. Feche a janela direita da cadeira do primata. Para testar a capacidade de compreender pellets na caixa de Brinkman sob controle visual, aberto a faceta superior da caixa. Encher a caixa com as pelotas eo macaco executa o teste usando a mão direita. Feche a janela direita da cadeira do primata. Encher a caixa com pellets. </li> Abra a janela do lado esquerdo da cadeira de primatas. O macaco executa o teste usando o passo hand.Repeat esquerda 2,5. 4. Teste 3: Rodar Brinkman bordo Este teste é comparável à tarefa bordo Brinkman (teste 1), exceto que a placa está rodando, forçando o macaco para antecipar o deslocamento da placa em um (sentido horário) ou outra direção (sentido anti-horário). Encher a placa com as pelotas. A seqüência é gravado com uma câmera digital colocada sobre o set-up (possibilidade também para colocar 2 câmeras adicionais, um de cada lado). Abra a janela direita da cadeira do primata. O macaco recupera os pellets dos 32 poços, distribuídos em quatro linhas concêntricas, enquanto que a placa está girando no sentido horário. Feche a janela da direita. Encher a placa com pellets. Abra a janela do lado esquerdo da cadeira de primatas. O macaco executa o teste como na 4.2 com a mão esquerda. Repita os pontos 4.2 a 4.4, enquanto a placa is giro anti-horário (uma mão após a outra). Repita o passo 2.5. 5. Teste 4: Reach e agarrar tarefa gaveta Para combinar a capacidade de preensão com a capacidade de gerar força, este teste (derivado de versões anteriores 6-11) foi desenhado para que o macaco tem que abrir uma gaveta, exercendo força de um primeiro controle sobre a maçaneta da gaveta, seguido por uma carga força para abrir a gaveta, dando acesso a um pellet colocado dentro da gaveta. O pellet é recuperado com a mesma mão, enquanto a gaveta permanece em aberto, novamente usando o aperto de precisão. Uma câmera digital é colocado em cima da gaveta, para gravar os ensaios para o off-line, controle dos dados (por exemplo, a detecção de tentativas erradas). Abra a janela direita da cadeira do primata. O macaco executa 10 testes em cada um dos cinco diferentes níveis de resistência, usando a mão direita (para ter pelo menos cinco julgamentos corretos para cada nível de resistência). Repita o teste (50 tentativas) com the mão esquerda. Repita o passo 2.5. Informações adicionais: Na próxima sessão de comportamento diário, alternativo a mão com que o animal fez o primeiro teste na sessão anterior. 6. Fim da sessão de comportamento Após a conclusão dos testes previstos naquele dia, alimentar e recompensar o macaco com alimentos, além do pellets recebeu durante os testes. Normalmente, o macaco recebe cereais e frutas. O macaco é retornado para a sala de alojamento em grupo com os companheiros. A seqüência temporal precisa dos vários testes realizados está escrito na ficha de protocolo. 7. Resultados representante Os quatro testes comportamentais ilustrado acima (Figura 1) têm sido amplamente utilizados em nosso laboratório no contexto dos estudos teve como objetivo investigar a recuperação funcional da lesão da medula espinhal cervical (Figura 2A) ou do córtex motor (Figura 2B), na ausência ou na presença de um tratamento aplicado para melhorar a recuperação espontânea 12-19. Para o teste de 1 (modificado Brinkman board), a análise está focada em dois parâmetros (Figuras 3 e 4A): i) a pontuação, dada pelo número de pellets recuperados pelo macaco nos primeiros 30 segundos, contados separadamente para os slots verticais e os slots horizontal (por repetir off-line, a seqüência de vídeo gravados); ii) o tempo de contato (TC), definido como o tempo (duração) de contato entre os dedos eo pellet (ver também Figura 6, série fundo de imagens ). É o intervalo de tempo entre a inserção do primeiro dedo (geralmente o dedo indicador) na ranhura para tocar a pelota eo início da recuperação da pelota para fora do poço. O intervalo de tempo é medido pela repetição quadro a seqüência do vídeo frame. O CT é medido para a vertic cinco primeirosranhuras al e os primeiros cinco slots horizontal destinada pelo macaco 16-18. Os gráficos da pontuação ilustrar a fase inicial de treinamento, o planalto pré-lesão, a queda dramática de pontuação (geralmente a zero) imediatamente após a lesão, a recuperação (espontânea) funcional progressiva em direção ao planalto pós-lesão. A recuperação funcional é expressa em% pela razão entre a pontuação pós-lesão no planalto médio dividido pela pontuação pré-lesão mediana (planalto) * 100 (Figuras 3 e 4A). Para o CT, como um aumento reflete um déficit, a recuperação funcional expressa em% é a razão entre a mediana pré-lesão CT (planalto), dividido pela mediana pós-lesão no CT planalto * 100. O efeito dos tratamentos pós-lesão, demonstrada com base no teste 1, estão ilustrados em detalhes em relatórios anteriores deste laboratório 14,15,17. Uma análise mais aprofundada pode abordar a questão da estratégia, ou seja, a seqüência temporal de aberturas visitado pelo monkey (Figura 4B). Para o teste 2 (caixa de Brinkman), embora a pontuação também pode ser estabelecido como no teste 1, um parâmetro mais significativo é o "tempo total", definido como o intervalo de tempo entre a colheita da pelota no primeiro slot e a colheita de o pellet no slot (20 ª) última (Figura 5). A recuperação funcional pode ser calculado e expresso em%. Ele é calculado usando o tempo médio total de pré-lesão (platô após a fase de treinamento), dividido pelo total de tempo médio pós-lesão no planalto * 100. Para o teste 3 (rotação Brinkman board), embora a pontuação também pode ser estabelecido como acima (teste 1), um parâmetro sensível é o tempo de contato (TC, definido como acima no teste 1), medido para os primeiros dez slots (Figura 6 ). Para o teste 4 (. Alcance e compreensão tarefa gaveta), o set-up comprises vários detectores, gravação de eventos discretos, como de início do estudo (a mão interrompe um feixe de luz colocada na frente do painel), mão tocando o botão, o início da gaveta puxando, fim da abertura da gaveta, a mão de entrar no slot (pick-no tempo ), a retirada lado do slot (pick-out). Transdutores de força na maçaneta permitem medir a força de preensão (exercida pelo polegar eo dedo indicador pressionando o botão) e da força de carga (exercida para puxar a gaveta, para contrabalançar os diferentes níveis de resistência imposta sobre a abertura da gaveta). Os diferentes níveis de resistência contra a abertura da gaveta foram obtidos pela mudança na intensidade de corrente aplicada a um motor eletromagnético rotativo conectado à parte traseira da gaveta. O set-up é projetado para aplicar uma força de resistência em paralelo com a orientação da abertura da gaveta. Esquema detalhado da gaveta set-up está disponível mediante pedido ao autor correspondente. Todos estes dados são recolhidos com a interface de umnd software de Spike 2 e exibido como ilustrado na Figura 7. Como anteriormente relatados1 4,15, essas tarefas representam a base comportamental para investigar se a recuperação espontânea de uma lesão da medula cervical pode ser melhorada com um tratamento específico destinado a promover a regeneração axonal (Figura 8). A pontuação de recuperação e os parâmetros tempo de contato refletem diferentes componentes da destreza manual: a primeira inclui a seqüência do motor inteiro (atingindo, agarrando, a retirada da mão, transporte de sedimento para a boca), enquanto a segunda é focada em a fase de agarrar somente. Estes dois parâmetros são particularmente precisos e complementares para a modificados e à rotação de tarefas Brinkman bordo. Considerando que a pontuação representa informações em grande parte redundante nestas duas tarefas, o tempo de contato em contraste fornece informações mais específicas da tarefa, devido àvariabilidade das posições das ranhuras "na tarefa de rotação bordo Brinkman, em comparação com a sua posição estática na tarefa modificada bordo Brinkman. A tarefa caixa de Brinkman difere os dois acima mencionados tarefas, como os graus de liberdade de movimentos com a mão são limitados pelo espaço fechado. Como conseqüência, as posições dos diferentes slots da placa dentro da caixa de Brinkman desempenhar um papel importante em termos de dificuldade para realizar a preensão manual, devido a exiguidade da caixa. Por exemplo, a apreensão com a mão dos slots localizados no lado direito da caixa interfere com a parede lateral direita. Consequentemente, a avaliação do escore de recuperação limitada a 30 segundos como no modificada Brinkman conselho seria tendencioso, dependendo da posição dos slots realmente visitado pelo macaco durante este período de tempo restrito, gerando uma variabilidade substancial de uma sessão para outra. Por esta razão, é mais apropriado para INVOLVE todos os slots (n = 20) e, portanto, o tempo total foi o parâmetro escolhido. No Brinkman modificada bordo, o tempo total não foi considerado, como o macaco pode, em alguns casos a motivação solto (por exemplo, pós-lesão), devido ao grande número de slots a serem realizados (n = 50). Na mesma linha, a análise do tempo de contato implicaria a tomar todas as aberturas da caixa de Brinkman em consideração (ao passo que apenas os primeiros cinco slots no Brinkman modificada bordo foram considerados como a posição dos slots selecionados tem pouco, se não impacto sobre este parâmetro). Portanto, para a caixa de Brinkman, recomendamos numa primeira abordagem para determinar o tempo total, como foi observado para ser um parâmetro altamente pertinente e informativo, pelo menos em nossos estudos com macacos submetidos a uma lesão do córtex motor (não há dados disponíveis para medula espinhal lesionada macacos). No entanto, o tempo de contato podem ser considerados para a caixa de Brinkman, mas em uma segunda etapa, incluindo todos os vinte e slots, separadamente, no entantopara os slots horizontal e vertical (não mostrado). Figura 1. Esquema geral do experimento. O animal é transferido do biotério para a cadeira de primatas, em seguida, transportados para o laboratório de comportamento. Em cada sessão diária, o macaco executa o teste 1. Em dias alternados, o macaco, em seguida, executa o teste 2, e / ou teste de 3, e / ou teste 4. Alguns macacos (especialmente motivado) pode realizar todos os testes na mesma sessão diária. Pelotas do alimento (usado como recompensa) foram feitos de banana seca ou pó de glicose que é comprimido em uma forma redonda de cerca de 4 mm de diâmetro. Em todos os nossos testes comportamentais, usamos pellets precisão dustless (45 mg) fornecidos por BioServ, Uma rua 8, Suite One, Frenchtown, NJ 08825, EUA. A dimensão da placa de Brinkman modificado é 240 milímetros de comprimento e 140 mm de largura, enquanto que a dimensão dos slots é de 15 mm de comprimento, 8 mm wide e 6 mm de profundidade. O diâmetro do bordo no rotativo Brinkman bordo é de 114 mm. . Figura 2 Representante lesão (cirúrgica) da medula cervical (painel A; modificado a partir do 15) e (química) lesão do córtex motor (painel B; modificado a partir do 16), derivada de cortes histológicos correspondentes, processados para a coloração SMI-32 . A extensão máxima da lesão da medula cervical foi reconstruído a partir de consecutivos cortes sagitais da medula espinhal (painel A), enquanto que a extensão ea posição da lesão do córtex motor foi reconstruído a partir de seções consecutivas frontal do cérebro e re-posicionado em uma vista lateral do hemisfério cerebral correspondente (mancha vermelha no painel B). A lesão da medula cervical resultou de uma transecção com uma lâmina de cirurgia no nível C7-C8, resultando em um sub-hemissecção interromper unilateralmente o principal componente do trato CSpermanente no funículo dorsolateral, acima da motoneurônios controlando músculos da mão 14,15,20. A lesão permanente cortical foi produzido pela infusão de ácido ibotênico 13,16,17, em sites que cobrem a representação mão previamente estabelecidos utilizando microstimulation intracortical (ICMS, ver 16,21,22). O território lesão cortical aparece como uma interrupção abrupta da coloração SMI-32 de neurônios nas camadas III e V no banco rostral do sulco central (área delimitada com a linha tracejada no painel B). Figura 3. Representante de dados derivado da tarefa modificada bordo Brinkman (teste 1) realizada por um macaco submetido a uma lesão da medula espinhal (como ilustrado na Figura 2A). O gráfico mostra a pontuação (ordenada), separadamente para as ranhuras verticais (símbolos azul) e os slots horizontal (símbolos vermelhos). Os símbolos amarelos são para a soma depontuações vertical e horizontal em uma determinada sessão diária. Na abscissa, o tempo é para os dias consecutivos de sessões de comportamento. O redline tracejada vertical (dia 0) é o dia em que a lesão foi realizada. Três períodos diferentes são destacadas: a primeira (linha tracejada preta) corresponde ao período de treinamento, o segundo (linha tracejada azul) para o platô de desempenho antes da lesão, eo terceiro (linha tracejada verde) para o planalto de recuperou o desempenho. Dados modificados a partir de 15. Figura 4A. Same como na Figura 3 (teste 1), mas em um macaco submetido a uma lesão do córtex motor (como ilustrado na figura 2B). Os gráficos mostram a pontuação (painel A; mesmas convenções como na Figura 3) eo tempo de contato (TC; painel B) de dados. Na abscissa, o tempo é paraos dias consecutivos de sessões de comportamento. O redline tracejada vertical (dia 0) é o dia em que a lesão foi realizada. No painel B, cada ponto corresponde ao tempo de contato entre o dedo eo pellet em um slot (5 ensaios por orientação de cada sessão, a barra cinza representa o valor médio). Note-se que para os ensaios em que o animal não poderia realizar a tarefa (imediatamente após a lesão), o CT aparece como um valor saturado a 5 segundos. Dados modificados a partir de 16,17. Figura 4B. Análise da estratégia adotada na tarefa modificada bordo Brinkman realizada com a mão contralesional, antes da lesão do córtex motor (pré), durante a fase de recuperação (Recovery) e pós-lesão no planalto (Post). A cor de cada slot indica a ordem seqüencial dos slots visitado por o macaco em uma sessão (o primeiro slot visitado é representado pelos mais sombrios azuis e último espaço visitado por mais escura a vermelho). Nota that pré-lesão, o macaco começou no lado esquerdo do tabuleiro e digitalizados sistematicamente para a direita. Durante a recuperação, a ordem seqüencial foi alterado. No planalto pós-lesão, a estratégia adotada pré-lesão re-apareceu (scan sistemática da esquerda para a direita). Figura 5. Representante de dados derivados da caixa de Brinkman (teste 2), para um macaco executar a tarefa sob controle visual. A ordenada é o tempo total necessário para esvaziar a 20 poços ao longo das sessões diárias (abscissa), realizado antes e depois de uma lesão do córtex motor (linha tracejada vertical). As dimensões do volume acessível dentro da caixa são 1360 centímetros 3 (120mm * 110mm * 103 milímetros). Nota uma fase inicial de treinamento, caracterizado por uma maior variabilidade do tempo total de uma sessão para a próxima. Imediatamente após a lesão cortical, omacaco não foi capaz de executar a tarefa (pontos de dados saturado a 200 segundos). O valor p é estatisticamente significativa a diferença entre o tempo médio total de pré-lesão (meio do retângulo horizontal cinza à esquerda) eo tempo total médio pós-lesão nas últimas sessões (no meio do retângulo horizontal cinza no canto direito ). A porcentagem de recuperação funcional é de 89,6% enquanto o volume da lesão córtex motor foi de 41,8 mm 3. Dados modificados a partir de 19. Figura 6. Os resultados representativos (dois primeiros gráficos) derivado do rotativo tarefa bordo Brinkman (teste 3), com ilustração do tempo de contato medidos pré-lesão e pós-lesão, com as mesmas convenções como na Figura 4A (painel B), para um macaco submetido a uma lesão do córtex motor (dados modificados a partir de 17). O gráfico de cima é para um horário ("Cl") ro ção do conselho, enquanto que o gráfico de fundo é uma rotação anti-horária ("C-Cl") do conselho. As duas setas verticais cinza indicam que o tempo de contato foi infinitamente longo em poucas sessões imediatamente após a lesão, como o macaco era incapaz de executar a tarefa com a mão contralesional. A série de imagens na parte inferior da figura ilustram o método para medir o tempo de contato (válido para ambos os Brinkman modificada bordo ea rotação Brinkman board). A imagem da esquerda mostra a mão aproximando o slot que contém o pellet (100 ms antes do contato entre o dedo indicador eo pellet). O próximo quadro à direita corresponde ao ponto de tempo de contato (0 ms). Então o tempo de contato é definido como o intervalo de tempo (em ms) rodando até alcançar o quadro (mais à direita um) correspondente ao ponto de tempo em que o pellet é levado para fora do slot. O tempo de contato aqui é de 240 ms. 58/3258fig7.jpg "/> Figura 7. Representante de dados derivado de uma sessão realizada por um macaco na tarefa de alcançar e agarrar gaveta (teste 4). Painel A: Os dados brutos correspondentes a três parâmetros adquiridos on-line durante uma única tentativa: a força de carga em vermelho, força de preensão em azul e deslocamento da gaveta em verde. Vários marcadores também foram adquiridos durante a tarefa: tempo escolhendo corresponde ao tempo de agarrar a recompensa total, aberto para a abertura total da gaveta e tocar o botão (tch) para o ponto no tempo quando o animal toca primeiro o botão. Para a análise, sete cursores foram posicionados em pontos momento crítico na tarefa de desdobramento (por exemplo, 3 cursores cinza na parte inferior três linhas horizontais): 1) tempo bloqueado ao toque do botão do animal; duas início) da força de preensão; 3) força de preensão máxima; início 4) da força de carga; 5) força de carga máxima; 6) Tempo bloqueado quando a gaveta está totalmente aberta; 7) tempo bloqueado para o tempo da colheita. Painel B: Representação dos resultados quantitativos por dois parâmetros gravados durante a tarefa: a força de preensão (força usada para captar o botão entre o dedo indicador eo polegar) ea força de carga (força usada para abrir a gaveta) em dois esquemas: o valor máximo (gráfico da esquerda) eo valor da inclinação (a partir do início ao máximo;. gráfico à direita). Quatro dos cinco diferentes níveis relativos de resistência foram ilustrados aqui: R0 (0 Newton), R3 (1,4 N), R5 (2,75 N) para R7 (5 N). O botão da gaveta tem uma forma triangular e plana. A base do triângulo ligado à gaveta medidas de 20mm e alto (15 mm a partir da base) consiste em um contorno circular de 7 mm de diâmetro. A gaveta em si tem as seguintes dimensões: comprimento = 50 mm; width = 27 mm e altura = 45mm. <p class="Jove_content"> Figura 8. Reminder (modificado a partir do 15) do uso do teste comportamental 1 a investigar o possível efeito de um tratamento (anti-Nogo-A anticorpo) na recuperação funcional da lesão medular cervical. Para ambas as pontuações e tempo de contato, bem como para ambas as orientações slot, o grupo de controle tratado de anticorpos macacos (símbolos azul; n = 6) recupera destreza manual menos bem do que o grupo de anti-Nogo-A anticorpo tratados macacos (símbolos vermelhos ; n = 7), especialmente para grandes volumes de lesão. Os dois grupos diferem significativamente, com p = 0,035 (painel A), p = 0,022 (painel B), p = 0,035 (painel C) e p = 0,008 (painel D).