Lo schema generale di questo esperimento è descritto nella Figura 1. 1. Animale preparazione e trasferimento al laboratorio di comportamento In laboratorio, preparare il comportamento di set-up: riempire i pozzi delle schede test differenti (test da 1 a 3) con il pellet, che servono come ricompensa durante le prove comportamentali. Trasferire la scimmia dalla sala del gruppo alloggiamento in una gabbia di trasferimento. La scimmia è addestrato per entrare in un tunnel che dà accesso alla sedia dei primati, con conseguente posizionamento della testa. Il peso della scimmia è misurata, prima del trasferimento sulla sedia dei primati al laboratorio. 2. Test 1: Modificato Brinkman bordo Questo test, modificato e adattato da relazioni precedenti 4,5, è il compito di comportamento di base di riferimento, da condurre su ogni sessione comportamentali. Avviare la registrazione video con la fotocamera digitale al di sopra del set-up (con possibilità anche di inserire il 2 admacchine fotografiche tradizionali, uno su ciascun lato della scheda) e posizionare la scimmia di fronte al consiglio Brinkman. Aprire ad esempio la finestra di destra sulla sedia dei primati per dare accesso alla mano destra. Con la mano destra, la scimmia recupera il pellet cibo dal 50 slot (25 orizzontali e 25 verticali). Dopo il completamento della prova, chiudere la finestra di destra e riempire la scheda con pellet. Aprire la finestra a sinistra e ripetere il test per la mano sinistra. Premiare l'animale al termine del test con un paio di uvetta secca o una mandorla, una procedura da ripetere alla fine di ogni prova a mantenere la motivazione durante l'intera sessione giornaliera. Ulteriori informazioni: Tre videocamere digitali vengono utilizzati per registrare la sequenza di elaborazione off-line, posti uno sopra la tavola e uno su ciascun lato della scheda (per valutare con precisione la posizione delle dita durante l'esecuzione della afferrare). All'interno della stessa sessione giornaliera, °scimmia e in grado di eseguire un'altra operazione (sia compito 2, e / o attività 3 e / o attività 4, da distribuire tra i diversi giorni della settimana). Per il test 1, se la scimmia ha iniziato con la mano destra il giorno 1, iniziare con la mano sinistra il giorno 2 e così via. Opzionale: se il test eseguito in precedenza con l'una o l'altra separatamente consente a confronto le prestazioni della mano sinistra alla mano destra (per identificare la "mano dominante"), è possibile anche in una fase iniziale della formazione per consentire al scimmia eseguire il compito con entrambe le mani contemporaneamente. Se da un lato è usato più spesso rispetto agli altri di cogliere pellet, allora può essere considerato come la "mano preferito". 3. Test 2: Brinkman box (con e senza controllo visivo) La casella di Brinkman comprende 20 pozzi (10 orizzontali e 10 verticali). Rispetto al test 1, la scimmia ha per controllare la mano in uno spazio limitato, con ridotti gradi di libertà di svolgere la precisionepresa movimento. Riempire la scheda con pellet e chiudere la sfaccettatura superiore della scatola, per condurre il primo test in assenza di controllo visivo (basandosi su esplorazione tattile). Posizionare la scimmia di fronte al box Brinkman. Aprire la finestra di sinistra della sedia primati per testare la mano sinistra in assenza di controllo visivo. La scimmia tenta di recuperare il 20 palline, mentre la sequenza viene registrata da una fotocamera digitale posta sotto la casella. Chiudere la finestra di sinistra della sedia primati. Riempire la scheda con pellet. Aprire la finestra a destra della sedia primati. La scimmia ripete la prova con la mano destra in assenza di controllo visivo. Chiudere la finestra a destra della sedia primati. Per testare la capacità di cogliere pellet nel box Brinkman sotto controllo visivo, aprire la sfaccettatura superiore della finestra. Riempire la scatola con pellet e la scimmia esegue il test utilizzando la mano destra. Chiudere la finestra a destra della sedia primati. Riempire la scatola con pellet. </li> Aprire la finestra di sinistra della sedia primati. La scimmia esegue il test utilizzando il passo sinistro hand.Repeat 2.5. 4. Test 3: Rotazione Brinkman bordo Questo test è paragonabile al compito Brinkman scheda (prova 1), tranne che la scheda è in rotazione, costringendo la scimmia di anticipare lo spostamento della tavola in uno (in senso orario) o l'altra direzione (in senso antiorario). Riempire la scheda con pellet. La sequenza è registrato con una fotocamera digitale posta al di sopra del set-up (con possibilità anche di inserire 2 telecamere addizionali, uno su ciascun lato). Aprire la finestra a destra della sedia primati. La scimmia recupera il pellet dal 32 pozzi, distribuiti su quattro file concentriche, mentre la scheda è in senso orario. Chiudere la finestra di destra. Riempire la scheda con pellet. Aprire la finestra di sinistra della sedia primati. La scimmia esegue il test come in 4.2 con la mano sinistra. Ripetere punti 4.2 punti 4.4, mentre la scheda is in senso antiorario (una mano dopo l'altra). Ripetere il punto 2.5. 5. Test 4: Reach e afferrare compito cassetto Per combinare la capacità prensione con la capacità di generare forza, questo test (derivato dalle versioni precedenti 6-11) è stato progettato in modo che la scimmia deve aprire un cassetto esercitando prima una forza di presa sul pomello del cassetto, seguito da un carico forza per aprire il cassetto, che dà accesso ad una pallina posta all'interno del cassetto. Il pellet viene recuperato con la stessa mano, mentre il cassetto rimane aperta, sempre con la presa di precisione. Una fotocamera digitale è posizionato sulla parte superiore del cassetto, per registrare le prove off-line per il controllo dei dati (ad esempio il rilevamento di prove errate). Aprire la finestra a destra della sedia primati. La scimmia compie 10 studi a ciascuno dei 5 diversi livelli di resistenza, utilizzando la mano destra (per avere almeno 5 prove corrette per ogni livello di resistenza). Ripetere il test (50 studi) con °e la mano sinistra. Ripetere il punto 2.5. Ulteriori informazioni: Sulla prossima sessione del comportamento quotidiano, si alternano la mano con cui l'animale ha fatto il primo test sulla sessione precedente. 6. Fine della sessione di comportamento Dopo il completamento delle analisi previste in quel giorno, alimentare e premiare la scimmia con il cibo, oltre al pellet ottenuto durante le prove. Tipicamente, la scimmia riceve cereali e frutta. La scimmia è tornato nella stanza gruppo scatola con i compagni. La precisa sequenza temporale delle varie prove effettuate è scritto sul modulo di protocollo. 7. Rappresentante Risultati I quattro test comportamentali sopra illustrato (Figura 1) sono stati ampiamente utilizzati nel nostro laboratorio nel contesto di studi volti a indagare il recupero funzionale da lesione del midollo spinale cervicale (Figura 2A) o della corteccia motoria (Figura 2B), in assenza o in presenza di un trattamento applicato per migliorare il recupero spontaneo 12-19. Per il test 1 (modificato Brinkman bordo), l'analisi si concentra su due parametri (figure 3 e 4A): i) il punteggio, dato dal numero di palline recuperate dalla scimmia nei primi 30 secondi, contati separatamente per gli slot verticale e gli slot orizzontale (da riprodurre off-line la sequenza registrata video), ii) il tempo di contatto (CT), definito come il tempo (durata) di contatto tra le dita e il pellet (vedi anche figura 6, serie di immagini in basso ). E 'l'intervallo di tempo tra l'inserimento del primo dito (di solito il dito indice) nello slot di toccare il pellet e l'insorgenza di recupero del pellet fuori dal pozzo. L'intervallo di tempo si misura con riproduzione fotogramma per fotogramma della sequenza video. Il CT è misurata per i primi cinque VerticAl slot e le prime cinque slot orizzontale volta dalla scimmia 16-18. I grafici del punteggio illustrare la fase iniziale di formazione, il pre-lesione altopiano, il calo drammatico della partitura (di solito a zero) immediatamente dopo la lesione, il progressivo (spontanea) il recupero funzionale verso il post-lesione plateau. Il recupero funzionale è espressa in% in base al rapporto della mediana post-lesione punteggio a plateau diviso per la media pre-lesione punteggio (altopiano) * 100 (figure 3 e 4A). Per il CT, come un aumento riflette un deficit, il recupero funzionale espresso in% è il rapporto tra la mediana pre-lesione CT (altopiano) diviso per la media di post-lesione CT a plateau * 100. L'effetto dei trattamenti post-lesione, dimostrata in base al test 1, sono illustrati in dettaglio nelle relazioni precedenti da questo laboratorio 14,15,17. Un'ulteriore analisi può affrontare la questione della strategia, cioè la sequenza temporale di slot visitato dal monkey (Figura 4B). Per il test 2 (box Brinkman), anche se il punteggio può anche essere stabilita come nella prova 1, un parametro più significativo è il "tempo totale", definito come l'intervallo di tempo tra la raccolta del pellet nel primo slot e la raccolta di il pellet negli ultimi (20 °) Slot (Figura 5). Un recupero funzionale può essere calcolato ed espresso in%. Si è calcolato utilizzando il tempo medio totale di pre-lesione (altopiano dopo la fase di formazione) divisa per la mediana tempo totale di post-lesione al plateau * 100. Per il test 3 (rotazione Brinkman bordo), anche se il punteggio può anche essere stabilita come sopra (prova 1), un parametro è sensibile il tempo di contatto (CT, definito come sopra nel test 1), misurata per i primi dieci slot (Figura 6 ). Per il test 4 (. Raggiungere e afferrare compito cassetto), il set-up comprises rivelatori diversi, registrazione eventi discreti come prova di iniziazione (la mano interrompe un fascio di luce posta di fronte al pannello), mano che tocca la manopola, l'esordio di cassetto tirando, fine di aprire cassetti, a mano che entrano nello slot (pick-in ), il ritiro a mano dallo slot (pick-out). Trasduttori di forza sulla manopola permette la misurazione della forza di presa (esercitata dal pollice e l'indice premendo sulla manopola) e la forza di carico (esercitata per estrarre il cassetto, per contrastare i diversi livelli di resistenza imposto l'apertura cassetto). I diversi livelli di resistenza opposte l'apertura del cassetto sono stati ottenuti modificando l'intensità di corrente applicata ad un motore elettromagnetico rotativo collegato al retro del cassetto. Il set-up è stato progettato per applicare una forza resistivo in parallelo l'orientamento di apertura del cassetto. Schema dettagliato del cassetto set-up è disponibile su richiesta per l'autore corrispondente. Tutti questi dati vengono raccolti con l'interfaccia di unSpike 2 ° software e visualizzati come illustrato in figura 7. Come precedentemente reported1 4,15, queste attività costituiscono la base del comportamento di verificare se il recupero spontaneo da una lesione del midollo cervicale può essere migliorata con un trattamento specifico volto a promuovere la rigenerazione assonale (Figura 8). Il punteggio di recupero ed i parametri di tempo di contatto riflettono diverse componenti della manualità: la prima comprende l'intera sequenza del motore (raggiungere, afferrare, il ritiro del trasporto a mano, del pellet alla bocca), mentre la seconda è focalizzata sulla la fase di afferrare solo. Questi due parametri sono particolarmente precise e complementari per la modifica e la rotazione Brinkman compiti di bordo. Mentre il punteggio rappresenta le informazioni in gran parte ridondanti in queste due attività, il tempo di contatto in contrasto fornisce informazioni più specifiche task-a causa dellavariabilità delle posizioni degli slot 'nel compito di rotazione Brinkman bordo, rispetto alla loro posizione statica nel compito modificato Brinkman bordo. Il compito scatola Brinkman si differenzia dalle due operazioni di cui sopra, come i gradi di libertà dei movimenti con la mano sono limitate dallo spazio chiuso. Di conseguenza, le posizioni dei diversi slot sulla scheda all'interno della scatola Brinkman svolgono un ruolo importante in termini di difficoltà di eseguire la prensione manuale, a causa della esiguità della scatola. Per esempio, l'afferrare con la mano dagli slot posto sul lato destro della finestra di interferisce con la parete laterale destra. Di conseguenza, la valutazione del punteggio di recupero limitato a 30 secondi come nel modificata Brinkman consiglio sarebbe viziato a seconda della posizione degli slot effettivamente visitato dai scimmia durante questo periodo di tempo limitato, generando una notevole variabilità da una sessione all'altra. Per questo motivo, è più opportuno Involve tutti gli slot (n = 20) e quindi il tempo totale parametro è stato scelto. Nel Brinkman modificato bordo, il tempo totale non è stata considerata, come la scimmia può in alcuni casi la motivazione sciolti (per esempio post-lesione) a causa del gran numero di slot da eseguire (n = 50). Lungo la stessa linea, l'analisi del tempo di contatto implicherebbe di prendere tutte le fessure della scatola Brinkman in considerazione (mentre solo i primi cinque slot nella Brinkman modificato bordo sono stati considerati come la posizione degli slot selezionato ha poco, se non impatto su questo parametro). Pertanto, per la casella di Brinkman, si consiglia un primo approccio per determinare il tempo totale, come è stato osservato per essere un parametro estremamente pertinente e informativo, almeno nei nostri studi con le scimmie sottoposte a una lesione corteccia motoria (dati non disponibili per midollo spinale lesionato scimmie). Tuttavia, il tempo di contatto può essere considerato per la casella di Brinkman, ma in un secondo momento tra cui tutte e venti le slot, ma separatamenteper le fessure orizzontali e verticali (non mostrato). Figura 1. Schema generale dell'esperimento. L'animale è trasferito dalla struttura di animale sulla sedia dei primati, poi trasportato al laboratorio comportamentale. Su ogni sessione giornaliera, la scimmia esegue il test 1. A giorni alterni, la scimmia esegue poi test 2, e / o prova 3, e / o test 4. Alcune scimmie (soprattutto motivati) può effettuare tutte le prove nella stessa sessione giornaliera. Pellet alimentare (usato come premio) sono state fatte di banane essiccate o glucosio in polvere che viene compressa in una forma circolare di circa 4 mm di diametro. In tutti i nostri test comportamentali, si usa pellet di precisione senza polvere (45 mg) forniti da BioServ, One 8th Street, Suite One, Frenchtown, NJ 08825, USA. La dimensione della Brinkman modificato tavola è lunga 240 millimetri e 140 mm di larghezza, considerando che la dimensione degli slot è di 15 mm, 8 mm wide 6 mm e profondo. Il diametro della tavola nella rotativo Brinkman consiglio è di 114 mm. . Figura 2 Rappresentante (chirurgica) lesione del midollo cervicale (pannello A; modificato da 15) e (chimica) lesione della corteccia motoria (pannello B; modificato da 16), derivata dalla corrispondente sezioni istologiche, trattati per SMI-32 colorazione . L'entità massima della lesione del midollo cervicale è stata ricostruita dal consecutivi sezioni sagittali del midollo spinale (pannello A), mentre la portata e la posizione della lesione corteccia motoria è stata ricostruita dal consecutivi sezioni frontali del cervello e ri-posizionato su un vista laterale dell'emisfero cerebrale corrispondente (macchia rossa nel pannello B). La lesione del midollo cervicale causato da un transezione con una lama chirurgica a livello C7-C8, con un conseguente sotto-emisezione interrompere unilateralmente il principale CS tratto componentipermanente nel funicolo dorsolaterale, al di sopra del controllo dei muscoli della mano motoneuroni 14,15,20. La lesione permanente corticale è stato prodotto da infusione di acido ibotenico 13,16,17, presso i siti che coprono la rappresentazione mano precedentemente stabilita utilizzando microstimolazione intracorticale (ICMS, vedi 16,21,22). Il territorio lesione corticale appare come una brusca interruzione della SMI-32 colorazione dei neuroni in strati III e V in banca rostrale del solco centrale (area delimitata con la linea tratteggiata nel pannello B). Figura 3. Rappresentante dei dati derivanti dal compito modificato Brinkman bordo (prova 1) eseguito da una scimmia sottoposta a una lesione del midollo spinale (come illustrato nella figura 2A). Il grafico mostra il punteggio (ordinata), separatamente per le fessure verticali (simboli blu) e le fessure orizzontali (simboli rossi). I simboli gialli sono per la somma dipartiture verticali e orizzontali su una determinata sessione giornaliera. In ascissa, il tempo è per i giorni consecutivi di sedute comportamentali. La linea rossa tratteggiata verticale (giorno 0) è il giorno in cui è stata effettuata la lesione. Tre periodi diversi vengono evidenziati: il primo (linea nera tratteggiata) corrisponde al periodo di formazione, la seconda (linea blu tratteggiata) per il parco di prestazioni prima della lesione, e la terza (linea verde tratteggiata) per il parco di recuperato le prestazioni. Dati modificati da 15. 4A figura. Uguale come in figura 3 (prova 1), ma in una scimmia sottoposto ad una lesione della corteccia motoria (come illustrato nella figura 2B). I grafici mostrano il punteggio (A pannello; stesse convenzioni in Figura 3) e il tempo di contatto (CT, pannello B) dei dati. In ascissa, il tempo è peri giorni consecutivi di sedute comportamentali. La linea rossa tratteggiata verticale (giorno 0) è il giorno in cui è stata effettuata la lesione. Nel pannello B, ogni punto corrisponde al tempo di contatto tra il dito e il pellet in uno slot (5 prove per l'orientamento per ogni sessione, la barra grigia rappresenta il valore mediano). Si noti che per le prove in cui l'animale non potrebbe svolgere il compito (subito dopo la lesione), il CT appare come un valore saturo a 5 secondi. Dati modificati da 16,17. 4B. Analisi della strategia adottata nel compito modificato Brinkman bordo eseguito con la mano contralesional, prima di lesione della corteccia motoria (Pre), durante la fase di recupero (recupero) e post-lesione a plateau (Post). Il colore di ogni slot indica l'ordine sequenziale degli slot visitato dalla scimmia in una sola seduta (il primo slot visitato è rappresentata dal blu più scuro e lo slot ultima visita dal rosso scuro). Nota that pre-lesione, la scimmia ha iniziato sul lato sinistro della tavola e scansione sistematica verso destra. Durante il recupero, l'ordine sequenziale è stato modificato. Al pianoro post-lesione, la strategia adottata pre-lesione riapparsi (scansione sistematica da sinistra a destra). Figura 5. Rappresentante dei dati derivati dalla finestra di Brinkman (test 2), per una scimmia all'esecuzione del compito sotto il controllo visivo. L'ordinata è il tempo totale necessario per svuotare i 20 pozzi lungo le sessioni giornaliere (ascissa), condotto prima e dopo una lesione della corteccia motoria (linea verticale tratteggiata). Le dimensioni del volume accessibile all'interno della scatola sono 1360 centimetri 3 (120mm * 110 millimetri * 103 millimetri). Nota una prima fase di formazione, caratterizzata da una maggiore variabilità del tempo totale da una sessione all'altra. Immediatamente dopo la lesione corticale, l'scimmia non era in grado di svolgere il compito (punti dati saturo a 200 secondi). Il valore p è statisticamente significativa la differenza tra il tempo medio totale di pre-lesione (al centro del rettangolo orizzontale grigio a sinistra) e il tempo totale medio post-lesione nelle ultime sessioni (al centro del rettangolo orizzontale grigia a destra ). La percentuale di recupero funzionale è 89,6%, mentre il volume della lesione corteccia motoria è di 41,8 mm 3. Dati modificati da 19. Figura 6. I risultati rappresentativi (in alto due grafici) derivato dal rotativo compito Brinkman pensione (prova 3), con l'illustrazione del tempo di contatto misurato lesione pre-e post-lesione, con le stesse convenzioni in Figura 4A (pannello B), per una scimmia sottoposto ad una lesione della corteccia motoria (dati modificati da 17). Il grafico in alto è per una in senso orario ("Cl") ro zione del consiglio, mentre il grafico in basso è per una in senso antiorario ("C-Cl"), la rotazione della tavola., Le due frecce verticali grigie indicano che il tempo di contatto è stata infinitamente lunga in poche sedute immediatamente dopo la lesione, come la scimmia era in grado di eseguire il compito con la mano contralesional. La serie di immagini sul fondo della figura illustra il metodo per misurare il tempo di contatto (valido sia per la Brinkman modificato bordo e la rotazione Brinkman bordo). L'immagine a sinistra mostra la mano si avvicina allo slot contenente il pellet (100 ms prima del contatto tra il dito indice e il pellet). Il fotogramma successivo a destra corrisponde al punto tempo di contatto (0 ms). Poi il tempo di contatto è definito come l'intervallo di tempo (in ms) in esecuzione fino a raggiungere il telaio (più a destra) corrispondente al punto temporale in cui viene preso il pellet dallo slot. Il tempo di contatto qui è di 240 ms. 58/3258fig7.jpg "/> Figura 7. Rappresentante dei dati derivati da una sessione eseguita da una scimmia sulla raggiungere e afferrare cassetto compito (prova 4). Un pannello: dati grezzi corrispondenti a tre parametri acquisiti in linea nel corso di un singolo trial: forza di carico in rosso, forza di presa in blu e lo spostamento del cassetto in verde. Marcatori diversi sono stati anche acquisiti durante il compito: tempo raccolta corrisponde al tempo della ricompensa afferrare, completamente aperta per l'apertura completa del cassetto e toccare la manopola (tch) al punto di tempo in cui l'animale tocca prima la manopola. Per l'analisi, sette i cursori sono stati posizionati nei punti momento critico nel compito svolgimento (es. 3 cursori grigia sul fondo tre linee orizzontali): 1) tempo chiuso al tatto della manopola da parte dell'animale, 2) comparsa di forza di presa; 3) la forza massima presa, 4) insorgenza di forza di carico; 5) forza di carico massimo; 6) tempo bloccato quando il cassetto è completamente aperto; 7) tempo bloccato per il tempo di prelievo. Pannello B: Rappresentazione dei risultati quantitativi per due parametri registrati durante il compito: la forza di presa (forza utilizzata per afferrare la manopola tra il dito indice e il pollice) e la forza di carico (forza usato per aprire il cassetto) in due diagrammi: il valore massimo (grafico a sinistra) e il valore della pendenza (da l'inizio al massimo;. grafico a destra). Quattro su cinque diversi livelli relativi di resistenza sono stati illustrati qui: R0 (0 Newton), R3 (1,4 N), R5 (2,75 N) a R7 (5 N). La manopola del cassetto ha una forma triangolare e piatta. La base del triangolo attaccato al cassetto misure 20mm e la parte superiore (15 mm dalla base) consiste in un contorno circolare di 7 mm di diametro. Lo stesso cassetto ha le seguenti dimensioni: lunghezza = 50 mm, larghezza = 27 mm e altezza = 45mm. <p class="Jove_content"> Figura 8. Promemoria (modificato da 15) l'uso del test comportamentali 1 per studiare il possibile effetto di un trattamento (anti-Nogo-A anticorpi) sul recupero funzionale di lesione del midollo cervicale. Per entrambi i punteggi e tempo di contatto, oltre che per entrambi gli orientamenti slot, il gruppo di controllo trattati con anticorpi scimmie (simboli blu, n = 6) recupera la manualità meno bene rispetto al gruppo di anti-Nogo-A anticorpi trattati scimmie (simboli rossi n = 7), soprattutto per i grandi volumi di lesione. I 2 gruppi differenze significative con p = 0,035 (pannello A), p = 0,022 (pannello B), p = 0,035 (pannello C) e p = 0,008 (pannello D).