유전과 Epigenetic 분석을위한 파라핀 임베디드 재료에서 DNA 추출

<p class="jove_title"> 1. 절차 노트</p><ul><li> 크실렌과 페놀은 독성 화학 물질 있으며 fumehood에서 처리되어야합니다. 사용하기 전에 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 참조하십시오.</li><li> 크실렌 특정 플라스틱을 녹이고, 그들은이 화합물을 용납 같은 폴리 프로필렌 튜브를 사용해야합니다.</li><li> 특별 팁는 내부 숯불 스토퍼를 포함하는 것을 구입하실 수 있습니다. 이것은 피펫에 고무 구성 요소를 해소에서 크실렌을 방지합니다. 또는 필터 팁을 사용할 수 있습니다.</li></ul><p class="jove_title"> 2. 파라핀 제거</p><ol><li> fumehood에서 파라핀을 해산 5 ~ 15 분 정도 부드럽게 잡고 락커에 표본과 장소를 포함하는 레이블 튜브에 크실렌 800 μl (VWR, CABDH6216 – 4)을 추가합니다.</li><li> 펠렛 3 분 microcentrifuge에서 최대 속도 (14,000 RPM 또는 16 000 XG)에서 회전하여 샘플. 조심스럽게 크실렌 뜨는을 철회하고 크실렌 폐기물의 폐기를위한 폴리 프로필렌 튜브에 폐기. 펠렛을 방해하지 않도록주의하십시오.</li><li> 크실렌 세척 단계 1을 반복하고 2until 파라핀이 완전히 녹아있다. 이것은 일반적으로 조직 표본의 크기에 따라 2-3 세척이 필요합니다. 완전히 녹아 샘플 부드러운 나타납니다, 그리고 때로는 그 구조적 무결성을 잃게됩니다. 샘플의 무결성은 부드럽게 피펫 팁로 평가하실 수 있습니다.</li></ol><p class="jove_title"> 3. 에탄올 rehydration</p><ol><li> 100 % 에탄올 (V / V) 분자 생물학 등급 에탄올, 소용돌이 800 μl를 추가 후 microcentrifuge에서 14,000 rpm으로 3 분 돌린다. 펠렛을 방해하지 않도록주의하고, 에탄올 뜨는을 제거합니다.</li><li> 70 % 에탄올 800 μl (100 % (V / V) 증류수에 희석 에탄올을 (DH 추가₂ O)), 소용돌이, 그리고 14,000 RPM에서 3 분간 돌린다. 조심스럽게 에탄올 뜨는을 제거합니다.</li><li> 50 % 에탄올 800 μl (100 % (V / V) 증류수에 희석 에탄올을 (DH 추가₂ O)), 소용돌이, 그리고 14,000 rpm으로 5 분간 돌린다. 조심스럽게 pipetting하여 가능한 한 많은 에탄올로 제거합니다. 완전히 rehydrated 조직하지 않습니다 펠렛뿐만 아니라 탈수 조직으로이 시점에서 펠렛을 방해 매우주의하십시오.</li><li>하고 5 분 동안 에탄올 뜨는, 공기 건조 펠렛을 제거한 후 조심하지여 건조합니다.</li></ol><p class="jove_title"> 4. 조직 소화</p><ol><li> 용해 버퍼의 200-500 μl (아래 수식)을 추가합니다. 펠렛은 피펫 팁 또는 소용돌이를 사용하여 다시 일시 중지합니다. 이 시점에서 추가적인 노력 완전히 다시 중단 조직 샘플을보다 완벽하게 소화하고 DNA의 좋은 수율로 얻을 수 있습니다.</li><li> 56 샘플을 품어 ° 물 목욕이나 가열 블록에서 C.</li><li> 조직 코어의 경우, 스파이크 proteinase K (20 MG / ML 주식 솔루션, Invitrogen, AM2548) 아침과 저녁에 20 μl.</li><li조직이 완전히 해소 될 때까지> 2~5일에 대한 소화 위의 단계를 반복합니다.</li></ol><p class="jove_step"> 용해 완충액</p<ul><li> 10 MM 트리스 – HCL의 산도 8.0</li><li> 100 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 산도 8.0</li><li> 50 MM NaCl</li><li> 0.5 % SDS</li><li> 200 μg / ML proteinase K는 (바로 사용하기 전에 추가)</li></ul><p class="jove_title"> 5. DNA는 청소</p><ol><li> 페놀 포화 (피셔, BP1750I – 400)과 역전의 혼합 버퍼의 동일한 볼륨을 추가합니다. microcentrifuge에서 14,000 rpm으로 적어도 5 분간 스핀.</li><li> 새로운 튜브로 수성 레이어를 전송합니다. 계면 참고 : 흰색 소재의 많은 있나요?</li><li계면은 (일반적으로 3 번 이상) 명확 때까지> 수성 분율에서 1 단계와 2 단계를 반복합니다. extractions 다시 수행 * 계면이 최종 수율을 높이기 위해 퍼지 때.</li><li샘플의 추출 수성 분율에 isoamyl 알코올 (25:24:1) (피셔, BP1752I – 400) : 클로로포름 : 계면이 분명하다> 일단, 페놀의 동일한 볼륨을 추가합니다. 5 분 혼합 후 14,000 rpm으로 5 분간 돌린다. 잔여은 페놀 및 추가 수성 층의 추출을 촉진, 계면을 선명 Thisreduces</li><li> 37에서 1 시간 동안 100 μg / ML에 새로운 튜브로 수성 레이어를 제거하고 treatwith RNase ° C.</li><li> 남아있는 RNase를 제거하고 수성 분수를 수집하기 위해 4 단계를 반복합니다. 초기 lysate에서보다 훨씬 덜 제거하는 단백질이 있어야로 당신은 단지 1 개 또는 2 버퍼 포화 페놀 단계가 필요합니다.</li></ol><p class="jove_content"> * extractions는 DH의 50-100 μl를 추가 다시 수행하려면<sub> 2</sub계면> 0. 믹스, 그리고 5 분 microcentrifuge에서 14,000 rpm으로 샘플을 회전하기 위해 튜브를 반전. 수성 단계를 수집하고 이전에 취득한 수성 추출에 추가합니다. 계면 분명히 때까지 extractions 다시 계속합니다.</p><p class="jove_title"> 6. DNA 침전</p><ol><li> 귀하의 수집 수성 층의 볼륨을 예상하고있다.</li><li> 10분의 1 3 M의 아세트산 나트륨의 산도 5.2의 볼륨을 100 % 이소프로판올 (V / V) 분자 생물학 등급 (또는 100 % 에탄올 2.5 권) 1 볼륨을 추가합니다.</li><li> 잘 믹스 30 분 또는 숙박에 대해 얼음 또는 -20 ° C의 냉동고에 넣어.</li><li4 최대 속도> 스핀 (14,000 RPM) ° C 10 분 microcentrifuge로</li><li> 뜨는 폐기하십시오.</li><li> 원치 않는 소금을 제거하는 70 %의 얼음 차가운 에탄올과 펠릿 씻으십시오.</li><li선택의 버퍼에> 다시 중단 펠릿 (보통 DH₂ O).</li></ol><p class="jove_title"> 7. DNA의 양을 정함</p><ol><li> DNA의 농도를 정량. A260 : A280 비율 ~ 1.8하여야한다. DNA의 소량 들어, NanoDrop 분광 광도계를 사용하여 측정하는 것이 좋습니다.</li><li> 다음 부량, 젤 전기 영동은 DNA 샘플의 품질을 테스트하고 오염 RNA가 완전히 저하되었는지 여부를 확인하기 위해 수행되어야합니다.</li><li> 고품질 추출한 DNA는 이제 스트림 애플 리케이션에 적합하거나 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. RNA가 아직 샘플에있는 경우, DNA가 깨끗하고 석출 단계 반복하고 다시 계량 및 샘플의 품질을 한정.</li></ol>