Extraction d'ADN de matériel inclus en paraffine pour les analyses génétiques et épigénétiques
Summary
Cette vidéo montre le protocole d'extraction d'ADN à partir du matériel fixé au formol et inclus en paraffine. Ceci est une procédure de plusieurs jours dans lequel des coupes de tissus sont déparaffinées avec du xylène, réhydratée avec de l'éthanol et traités à la protéinase K pour purifier et d'isoler l'ADN pour l'analyse des gènes spécifiques ou du génome à l'échelle suivante.
Abstract
Le développement et la progression de la maladie sont caractérisés par de fréquentes aberrations génétiques et épigénétiques dont les réarrangements chromosomiques, les gains et pertes du nombre de copies et de méthylation de l'ADN. Les progrès de la haut-débit, les technologies de profilage du génome entier, comme les microréseaux, ont considérablement amélioré notre capacité d'identifier et de détecter ces altérations spécifiques. Cependant, comme la technologie continue de s'améliorer, un facteur limitant reste la qualité de l'échantillon et de disponibilité. Par ailleurs, le suivi des informations cliniques et évolution de la maladie sont souvent recueillies ans après le prélèvement de l'échantillon initial. Les spécimens, généralement fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE), sont stockés dans les archives de l'hôpital pour les années à plusieurs décennies. L'ADN peut être efficacement et effectivement récupérés à partir des échantillons inclus en paraffine, si la méthode appropriée d'extraction est appliquée. L'ADN de haute qualité extraite à partir de spécimens bien conservés et stockés peuvent soutenir dosages quantitatifs pour les comparaisons des tissus normaux et malades et la génération de signatures génétiques et épigénétiques 1. Pour extraire l'ADN à partir d'échantillons inclus en paraffine, les carottes de tissus ou de tissus microdisséquées sont soumis à un traitement xylène, qui dissout la paraffine du tissu, puis réhydratée en utilisant une série de lavages éthanol. Protéines et des enzymes nuisibles tels que les nucléases sont ensuite digérées par la protéinase K. L'ajout de tampon de lyse, qui contient des agents dénaturants tels que le dodécylsulfate de sodium (SDS), facilite la digestion 2. Les acides nucléiques sont purifiés à partir du lysat de tissu à l'aide du tampon saturé centrifugation à vitesse élevée de phénol et qui génère une solution biphasique. ADN et ARN restent dans la phase aqueuse supérieure, tandis que les protéines, les lipides et les polysaccharides sont séquestrés dans les inter-et bio-phases, respectivement. Conservation de la phase aqueuse et répétée extractions au phénol génère un échantillon propre. Après extractions au phénol, RNase A est ajouté pour éliminer l'ARN contaminant. D'autres extractions au phénol après incubation avec de la RNase A sont utilisés pour éliminer toute enzyme restante. L'ajout d'acétate de sodium et de l'ADN précipite l'isopropanol, et centrifugation à grande vitesse est utilisé pour agglomérer l'ADN et de faciliter le retrait d'isopropanol. L'excès de sel reportés de précipitations peuvent interférer avec les dosages enzymatiques ultérieures, mais peut être retiré de l'ADN par lavage à l'éthanol à 70%, suivie par une centrifugation de re-pellets l'ADN 3. L'ADN est remis en suspension dans l'eau distillée ou du tampon de choix, quantifiés et conservés à -20 ° C. ADN purifié peut ensuite être utilisé dans des applications en aval qui incluent, mais ne sont pas limités à, PCR, hybridation génomique comparative 4 (CGH array), immunoprécipitation ADN méthylé (MeDIP) et le séquençage, permettant une analyse intégrative des échantillons de tissu / tumeur.
Protocol
Discussion
Tissus biopsiés ou chirurgicalement excisés pour l'analyse et le diagnostic histopathologique sont souvent fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) pour le stockage à long terme. Avec l'intérêt croissant dans la compréhension des bases génétiques de la maladie, la capacité d'extraire l'ADN de ces échantillons représente une source inestimable de matériel de diagnostic qui peut être utilisé pour l'analyse génomique et les études translationnelles. Historiquement échantillons FFPE n'étaient pas considérés comme une source viable pour l'analyse moléculaire des acides nucléiques peuvent être fortement modifiées par la protéine-acide nucléique et des protéines-protéines réticulation 6. Cependant, la découverte que la digestion de protéase communiqués fragmenté acides nucléiques qui sont adaptés pour des analyses en aval, y compris la PCR, CGH array, le séquençage et le profilage de méthylation, permet l'utilisation de ces spécimens précieux pour l'analyse génétique 6.
L'extraction d'ADN à partir des tissus inclus en paraffine est une procédure robuste qui s'appuie sur la solubilité différentielle pour purifier l'ADN. La qualité et la quantité d'ADN extrait et le succès de l'amplification d'ADN ultérieures dépend d'un certain nombre de paramètres avant, pendant et après l'extraction. Il s'agit notamment, mais sans s'y limiter: le type et la quantité de tissu, le type de fixateur utilisé pour la conservation des tissus, la durée de fixation, l'âge du bloc de paraffine et les conditions de stockage, ainsi que la longueur du segment d'ADN voulu être amplifiée 1,7. Retrait de la paraffine du tissu est l'étape la plus critique pour l'extraction de succès que la paraffine non dissous conduit à la qualité des échantillons pauvres et l'inhibition de l'amplification par PCR.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les membres du laboratoire de Lam pour leur évaluation et les critiques de cette vidéo et de l'article. Ce travail a été soutenu par des fonds des Instituts canadiens de recherche en santé.
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Xylene | VWR | CABDH6216- 4 | – |
| 1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Sorenson BioScience | 11510 | – |
| Spectrafuge 16M Microcentrifuge | Labnet | C0160-B | – |
| Lysis Buffer | – | – | 10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K |
| Proteinase K Stock Solution | Invitrogen | AM2548 | 20 mg/ml |
| Proteinase K Stock Solution | |||
| Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9 | Fisher | BP1750I-400 | – |
| Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) | Fisher | BP1752I-400 | – |
| RNase A | Roche | 10109169001 | 100mg |
| 3M sodium Acetate pH 5.2 | – | – | 40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave |
| ND 3300 Spectrophotometer | NanoDrop | – | – |
Referências
- Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods. Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).
- Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of ‘masked’ proteins. Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).
- Sambrook, J. o. s. e. p. h., R, D. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
- Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization. J Vis Exp. , (2008).
- Thu, K. L. Methylated DNA immunoprecipitation. J Vis Exp. , (2009).
- Tang, W. DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Cold Spring Harb Protoc. , (2009).
- Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues. Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).
