Extracción de ADN a partir de material incluido en parafina para análisis genéticos y epigenéticos
Summary
Este video muestra el protocolo para la extracción de ADN de fijado en formol e incluido en parafina de material. Este es un procedimiento de varios días en los que las secciones de tejido se deparaffinized con xileno, rehidratada con etanol y se tratan con proteinasa K para purificar y aislar el ADN para su posterior análisis de genes específicos o en todo el genoma.
Abstract
Desarrollo de la enfermedad y la progresión se caracteriza por frecuentes aberraciones genéticas y epigenéticas como reordenamientos cromosómicos, las ganancias y las pérdidas del número de copias y la metilación del ADN. Los avances en alto rendimiento, tecnologías de perfilado todo el genoma, como los microarrays, han mejorado significativamente nuestra capacidad para identificar y detectar esas alteraciones específicas. Sin embargo, como la tecnología continúa mejorando, sigue siendo un factor limitante de la calidad de la muestra y la disponibilidad. Información clínica, además, el seguimiento y la evolución de la enfermedad se recogen a menudo años después de la recolección de la muestra inicial. Muestras, por lo general fijado en formol e incluidas en parafina (FFPE), se almacenan en los archivos del hospital durante años o décadas. ADN puede ser eficiente y eficaz se recuperó de las muestras incluidas en parafina, si el método adecuado de extracción se aplica. ADN de alta calidad extraído de muestras de adecuada conservación y almacenados pueden apoyar los ensayos cuantitativos para la comparación de los tejidos normales y enfermos y la generación de firmas genéticas y epigenéticas 1. Para extraer el ADN de las muestras incluidas en parafina, las muestras de tejido o tejido microdissected son sometidos a un tratamiento xileno, que se disuelve la parafina de los tejidos, y luego rehidratado con una serie de lavados de etanol. Proteínas y enzimas perjudiciales como nucleasas son posteriormente digeridos por proteinasa K. La adición de tampón de lisis, que contiene agentes desnaturalizantes como el dodecilsulfato sódico (SDS), facilita la digestión 2. Los ácidos nucleicos son purificados a partir del lisado de tejido con buffer saturado de velocidad de centrifugado de alta fenol y que genera una solución bifásica. ADN y ARN permanecen en la fase acuosa superior, mientras que las proteínas, lípidos y polisacáridos son secuestradas en las inter-fases y orgánicos, respectivamente. La retención de la fase acuosa y se repite extracciones con fenol genera una muestra limpia. Después de una extracción con fenol, RNasa A se añade para eliminar la contaminación de ARN. Adicionales extracciones con fenol después de la incubación con RNasa A se utilizan para eliminar cualquier resto de la enzima. La adición de acetato de sodio y el ADN precipita isopropanol, y centrifugación de alta velocidad se utiliza para precipitar el ADN y facilitar la eliminación de isopropanol. El exceso de sales prorrogados de precipitación pueden interferir con la consiguiente ensayos enzimáticos, pero se puede quitar a partir del ADN mediante el lavado con etanol al 70%, seguido de centrifugación para volver a la pastilla de ADN 3. ADN se resuspendió en agua destilada o el buffer de la elección, cuantificado y almacenado a -20 ° C. ADN purificado posteriormente se puede utilizar en aplicaciones posteriores que incluyen, pero no se limitan a, PCR, hibridación genómica comparada serie 4 (CGH array), inmunoprecipitación de ADN metilado (MeDIP) y la secuenciación, lo que permite un análisis integral de las muestras de tejido / tumor.
Protocol
Discussion
Tejidos biopsia o extirpado quirúrgicamente para el análisis histopatológico y el diagnóstico son a menudo fijado en formol e incluidas en parafina (FFPE) para el almacenamiento a largo plazo. Con el creciente interés en la comprensión de las bases genéticas de la enfermedad, la capacidad de extraer el ADN de estas muestras representa una valiosa fuente de material de diagnóstico que pueden ser utilizados para el análisis genómico y los estudios de traducción. Históricamente muestras FFPE no fueron considerados una fuente viable para el análisis molecular de los ácidos nucleicos puede ser muy modificado por el ácido nucleico y proteína-proteína-proteína transversal que une 6. Sin embargo, el descubrimiento de que la digestión de la proteasa versiones fragmentadas ácidos nucleicos que son adecuados para análisis posteriores como PCR, CGH array, la secuenciación y perfiles de metilación, permite el uso de estos valiosos ejemplares para el análisis genético 6.
Extracción de ADN de tejidos embebidos en parafina es un procedimiento sólido que se basa en la solubilidad diferencial para purificar el ADN. Calidad y cantidad de ADN extraído y el éxito de la amplificación de ADN posterior depende de una serie de parámetros antes, durante y después de la extracción. Estos incluyen, pero no se limitan a: el tipo y la cantidad de tejido, el tipo de fijador utilizado para la preservación de los tejidos, la duración de la fijación, la edad del bloque de parafina y las condiciones de almacenamiento, así como la longitud del segmento de ADN que se desea amplificada 1,7. La eliminación de la parafina de los tejidos es el paso más crítico para la extracción de éxito como la parafina disuelta hace que la calidad de la muestra pobre y la inhibición de la amplificación por PCR.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio de Lam para su evaluación y las críticas de este video y artículo. Este trabajo fue financiado por los fondos de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud.
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Xylene | VWR | CABDH6216- 4 | – |
| 1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Sorenson BioScience | 11510 | – |
| Spectrafuge 16M Microcentrifuge | Labnet | C0160-B | – |
| Lysis Buffer | – | – | 10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K |
| Proteinase K Stock Solution | Invitrogen | AM2548 | 20 mg/ml |
| Proteinase K Stock Solution | |||
| Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9 | Fisher | BP1750I-400 | – |
| Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) | Fisher | BP1752I-400 | – |
| RNase A | Roche | 10109169001 | 100mg |
| 3M sodium Acetate pH 5.2 | – | – | 40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave |
| ND 3300 Spectrophotometer | NanoDrop | – | – |
Referências
- Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods. Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).
- Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of ‘masked’ proteins. Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).
- Sambrook, J. o. s. e. p. h., R, D. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
- Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization. J Vis Exp. , (2008).
- Thu, K. L. Methylated DNA immunoprecipitation. J Vis Exp. , (2009).
- Tang, W. DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Cold Spring Harb Protoc. , (2009).
- Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues. Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).
