Identificare i geni disregolazione indotta da sarcoma di Kaposi associato Herpesvirus (KSHV)
Summary
Fattori cellula ospite giocano un ruolo critico nella creazione e mantenimento di sarcoma di Kaposi (KS). Delineiamo metodi per identificare i fattori cellula ospite alterato nelle cellule DMVEC KSHV-infetti, e nel tessuto tumorale KS. Geni cellulari alterato da virus servirà come potenziale bersaglio (s) per nuove terapie.
Abstract
Attualmente KS è la più predominante l'HIV / AIDS neoplasie correlate in Sud Africa e quindi il mondo. 1,2 Si caratterizza come un tumore angioproliferative delle cellule dell'endotelio vascolare e produce rare malattie linfoproliferative delle cellule B nella forma di linfomi versamento pleurico (PEL) e alcune forme di malattia multicentrica di Castleman. 3-5 solo 1-5% delle cellule KS lesioni sostenere attivamente la replicazione litica di associato al sarcoma di Kaposi herpesvirus (KSHV), l'agente eziologico associato con KS, ed è chiaro che fattori cellulari devono interagiscono con fattori virali nel processo di oncogenesi e progressione del tumore. 6,7 Identificare romanzo host-fattore determinanti che contribuiscono a KS patologia è essenziale per lo sviluppo di marcatori prognostici per la progressione del tumore e delle metastasi, nonché per lo sviluppo di nuove terapie per il trattamento del KS . 8 La dettagli del video che accompagna i metodi che utilizziamo per identificare i programmi della cellula ospite espressione genica nel derma cellule endoteliali microvascolari (DMVEC) dopo l'infezione KSHV e nel tessuto tumorale KS 9. Una volta che i geni disregolazione sono identificati con l'analisi microarray, i cambiamenti nell'espressione delle proteine sono confermata da immunoblot e doppia immunofluorescenza etichettati. Cambiamenti nell'espressione della trascrizione dei geni disregolazione sono confermati in vitro con quantitativi in tempo reale reazione a catena della polimerasi (QRT-PCR). Validazione dei risultati in vitro utilizzando archivio tessuto tumorale KS è eseguita da due immunochimica etichettati e microarray di tessuto. 8,10 Il nostro approccio per individuare i geni disregolazione nel microambiente tessuto tumorale KS permetterà lo sviluppo in vitro e successivamente de sistemi modello in vivo per la scoperta e la valutazione delle potenzialità terapeutiche nuove per il trattamento del KS.
Protocol
Discussion
Le metodologie utilizzate in questo rapporto possono essere eseguite in una varietà di impostazioni di laboratorio. Essi richiedono alcune apparecchiature speciali o l'accesso alle strutture di base. Precauzioni devono essere prese quando si fa esperimenti infettive agenti patogeni virali come KSHV che può richiedere l'uso di un livello biosaftey 3 (BSL-3) strutture. Acquisizioni tessuti devono essere approvate dai consigli appropriati revisione istituzionale (IRB).
Queste metodolo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo James EK Hildreth, Meharry Medical College, per i suoi consigli e la revisione di questo manoscritto. Ringraziamo anche Diana Marver per l'editing del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Vanderbilt Meharry Centro per la ricerca sull'AIDS (NIH concedere AI054999 P30-05), il Centro per la Salute AIDS Research disparità, NIH concedere 5U54 RR019192-05; Meharry il Centro per la Ricerca Clinica, NIH di Grant P20RR011792 e dal NIH concedere P01 CA113239. DJA è stata in parte finanziata da sovvenzioni pilota della Vanderbilt-Meharry Centro per la ricerca sull'AIDS (CFAR) e il Centro Meharry per la Ricerca Clinica (CRC).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 05-0001DJ | ||
| TPA | Sigma | P1585 | ||
| PBS pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | ||
| Sodium butyrate | Sigma | 19364 (FLUKA) | ||
| EBM-2 media | Lonza | CC-3156 | + bullet kits supplement | |
| DMVEC cells (HMVEC) | Lonza | CC2543 | ||
| Fetal calf serum | Hyclone | SH30066.03 | ||
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Chamber slides | Nalgene | 154461 | ||
| KSHV LANA Mab | Vector Labs | VP-H913 | 1:50 dilution/IFA | |
| Galectin-3 goat pAb | R&D Systems | AF1154 | ||
| Donkey-anti-goat FITC | Jackson ImmunoRessearch | 705-095-1 | ||
| Donkey-anti-goat Rho | Jackson ImmunoRessearch | 705-295-003 | 1:100 dilution/IFA | |
| Mounting media | Vector Labs | H 1500 | Vectashield with DAPI | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23235 | ||
| Nitrocellulose | Bio-Rad | 161-0112 | ||
| Donkey-anti-goat-conj. | Santa Cruz | SC 2020 | ||
| Western substrate | Pierce | 34075 | ||
| Biotin-rabbit-anti goat | DAKO | 305-065-045 | ||
| AP-Strepavidin conj. | DAKO | K 0492 (kit) | ||
| RNase DNase Free Set | Qiagen | 79254 | ||
| MJ Mini Cycler | Bio-Rad | PTC-1148C | ||
| Bio-Photometer | Eppendorf | 952000006 | ||
| RC 6 Plus Centrifuge | Sorvall | 46910 | ||
| Coulter Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman | 392052 | ||
| MYiQ iCycler Real Time PCR Detection System | Bio-Rad | 170-9770 | ||
| TE 2000S Fluorescent microscope | NIKON | TE2000S | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938C | ||
| Eclipse E 200 | NIKON | E 200 | ||
| Sorvall Legend RT Centrifuge | Thermo | 75004377 |
Referências
- Sitas, F., Newton, R. Kaposi’s sarcoma in South Africa. J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).
- Moore, P. S., Chang, Y., Knipe, D. M., Howley, P. M. Kaposi’s sarcoma associated herpesvirus. Field’s Virology. , 2803-2833 (2002).
- Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J., Knowles, D. M., Moore, P. S. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P., Said, J. W., Knowles, D. M., M, D. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N Engl J Med. 18, 1186-1191 (1995).
- Cesarman, E., Knowles, D. M. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus: a lymphotropic human herpesvirus associated with Kaposi’s sarcoma, primary effusion lymphoma, and multicentric Castleman’s disease. Semin Diagn Pathol. 14, 54-66 (1997).
- Chiou, C. J., Poole, L. J., Kim, P. S., Ciufo, D. M., Cannon, J. S., ap Rhys, C. M., Alcendor, D. J., Zong, J. C., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. J Virol. 76, 3421-3439 (2002).
- Staskus, K. A., Zhong, W., Gebhard, K., Herndier, B., Wang, H., Renne, R., Beneke, J., Pudney, J., Anderson, D. J., Ganem, D., Haase, A. T., T, A. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus gene expression in endothelial (spindle) tumor cells. J Virol. 71, 715-719 (1997).
- Alcendor, D. J., Zhu, W. Q., Desai, P., Vigil, H. E., Hayward, G. S. KSHV downregulation of galectin-3 in kaposi’s sarcoma. Glycobiology. , (2009).
- Ciufo, D. M., Cannon, J. S., Poole, L. J., Wu, F. Y., Murray, P., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Spindle cell conversion by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus: formation of colonies and plaques with mixed lytic and latent gene expression in infected primary dermal microvascular endothelial cell cultures. J Virol. 75, 5614-5626 (2001).
- Long, E., Ilie, M., Hofman, V., Havet, K., Selva, E., Butori, C., Lacour, J. P., Nelson, A. M., Cathomas, G., Hofman, P. LANA-1, Bcl-2, Mcl-1 and HIF-1alpha protein expression in HIV-associated Kaposi sarcoma. Virchows Arch. 2, 159-170 (2009).
