确定失调卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）诱导的基因
Summary
宿主细胞因子发挥卡波西氏肉瘤（KS）的建立和维护的关键作用。我们概述的方法来识别宿主细胞在KSHV感染的DMVEC细胞改变的因素，在堪萨斯州的肿瘤组织。由病毒改变的细胞基因，将作为潜在目标（S）的新型疗法。
Abstract
目前，KS是在南部非洲的艾滋病毒/艾滋病的最主要相关的恶性肿瘤，因此世界。1,2 angioproliferative肿瘤血管内皮细胞的特点，并产生罕见的B细胞淋巴组织增生性疾病的形式在胸腔积液淋巴瘤（PEL）和3-5只有1-5％的细胞在KS病变的多中心Castleman病的某些形式。积极支持的卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV），与堪萨斯州相关的病原体裂解复制，很明显，细胞因子必须病毒因素在癌变和肿瘤的进展过程中进行交互 。6,7确定新的宿主因素决定因素有助于金水病理是必不可少的发展为肿瘤进展和转移预后指标以及开发新型疗法治疗的KS 8影随行的细节我们使用的方法来识别宿主细胞基因表达的KSHV感染后的方案，在KS肿瘤组织真皮微血管内皮细胞（DMVEC）改变。一旦失调基因芯片分析鉴定，蛋白表达的变化免疫印迹和双标记免疫荧光证实。失调基因的转录表达的变化实时定量聚合酶链反应（QRT – PCR）在体外证实。使用档案KS肿瘤组织在体外研究结果进行验证也是双标记免疫组化和组织芯片 8,10我们的方法来确定在KS肿瘤组织的微环境失调的基因， 将允许在体外和体内模型系统随后发展为发现和评估潜在的新的治疗，治疗的KS。
Protocol
1。 KSVH培养和感染DMVEC BCBL – 1细胞系，从人体腔基于淋巴瘤原本孤立的，是培养完整的RPMI 1640媒体（Gibco公司，大岛，纽约州）。 BCBL – 1细胞从液氮，干冰运输，1分钟快速解冻在37 ° C。一个BCBL – 1细胞的50μL分装密度1 × 10 4细胞/ mL，加入500毫升的RPMI 1640媒体辅以10％小牛血清，青霉素1X /链霉素，并分发到175厘米烧瓶，在50毫升/瓶。 BCBL – 1细胞的烧瓶，然后在37 ° C直到细胞?…
Discussion
在这份报告中所采用的方法可以进行各种实验室设置。他们需要一些特殊的设备或核心设施。涉及感染性病毒如KSHV的病原体，这可能需要一个biosaftey 3级（BSL – 3）设施的使用做实验时，必须采取适当的预防措施。组织收购，也必须由适当的机构审查委员会（IRBs）的批准。
这些方法可以提供确定基因， 在体外表达失调，并提供定义的方法，以及改变基因的表达谱基因?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
梅哈里医学院，詹姆斯EK Hildreth，我们感谢他的意见和对手稿的审查。我们也感谢戴安娜Marver的手稿的编辑。这项工作是支持梅哈里范德比尔特艾滋病研究中心（美国国立卫生研究院授予AI054999 P30 – 05）;艾滋病健康差距研究中心，美国国立卫生研究院授予5U54 RR019192 – 05;梅哈里临床研究中心，美国国立卫生研究院批准P20RR011792的;由NIH授予P01 CA113239。 DJA部分资金由试点补助艾滋病研究的范德比尔特梅哈里中心（CFAR）和梅哈里临床研究中心（CRC）。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 05-0001DJ | ||
| TPA | Sigma | P1585 | ||
| PBS pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | ||
| Sodium butyrate | Sigma | 19364 (FLUKA) | ||
| EBM-2 media | Lonza | CC-3156 | + bullet kits supplement | |
| DMVEC cells (HMVEC) | Lonza | CC2543 | ||
| Fetal calf serum | Hyclone | SH30066.03 | ||
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Chamber slides | Nalgene | 154461 | ||
| KSHV LANA Mab | Vector Labs | VP-H913 | 1:50 dilution/IFA | |
| Galectin-3 goat pAb | R&D Systems | AF1154 | ||
| Donkey-anti-goat FITC | Jackson ImmunoRessearch | 705-095-1 | ||
| Donkey-anti-goat Rho | Jackson ImmunoRessearch | 705-295-003 | 1:100 dilution/IFA | |
| Mounting media | Vector Labs | H 1500 | Vectashield with DAPI | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23235 | ||
| Nitrocellulose | Bio-Rad | 161-0112 | ||
| Donkey-anti-goat-conj. | Santa Cruz | SC 2020 | ||
| Western substrate | Pierce | 34075 | ||
| Biotin-rabbit-anti goat | DAKO | 305-065-045 | ||
| AP-Strepavidin conj. | DAKO | K 0492 (kit) | ||
| RNase DNase Free Set | Qiagen | 79254 | ||
| MJ Mini Cycler | Bio-Rad | PTC-1148C | ||
| Bio-Photometer | Eppendorf | 952000006 | ||
| RC 6 Plus Centrifuge | Sorvall | 46910 | ||
| Coulter Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman | 392052 | ||
| MYiQ iCycler Real Time PCR Detection System | Bio-Rad | 170-9770 | ||
| TE 2000S Fluorescent microscope | NIKON | TE2000S | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938C | ||
| Eclipse E 200 | NIKON | E 200 | ||
| Sorvall Legend RT Centrifuge | Thermo | 75004377 |
Referências
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Kaposi’s Sarcoma-associated HerpesvirusDysregulated GenesKSHVHIV/AIDSMalignancySouthern AfricaAngioproliferative TumorVascular Endothelial CellsB Cell Lymphoproliferative DiseasesPleural Effusion LymphomasMulticentric Castleman’s DiseaseLytic ReplicationOncogenesisTumor ProgressionHost-factor DeterminantsPrognostic MarkersMetastasisTherapeuticsDermal Microvascular Endothelial Cells (DMVEC)Microarray AnalysisProtein ExpressionImmunoblotDual Labeled ImmunofluorescenceTranscriptional ExpressionQuantitative Real-time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR)
Citar este artigo
Alcendor, D., Knobel, S. Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi’s Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV). J. Vis. Exp. (43), e2078, doi:10.3791/2078 (2010).