זיהוי גנים Dysregulated מושרה על ידי וירוס ההרפס הקשורים סרקומה של קפוסי (KSHV)
Summary
תא גורמים מארח לשחק תפקיד קריטי בהקמת ותחזוקה של סרקומה של קפוסי (KS). אנו המתאר שיטות לזיהוי התא המארח גורמים להשתנות KSHV תאים הנגועים DMVEC, וכן רקמת הגידול KS. גנים נייד שינו ידי וירוס תשמש יעד פוטנציאלי (ות) עבור הרפוי הרומן.
Abstract
נכון לעכשיו KS הוא השולט ביותר HIV / איידס ממאירות הקשורות בדרום אפריקה, ולכן את העולם. 1,2 הוא מאופיין כגידול angioproliferative לתאי אנדותל של כלי הדם ומייצר נדיר מחלות B תא lymphoproliferative בצורה של לימפומה השתפכות pleural (פל) וכמה צורות של המחלה multicentric של קסלמן. 3-5 רק 1-5% של תאים KS נגעים תומכים באופן פעיל שכפול ממס של קפוסי סרקומה הקשורים של וירוס ההרפס (KSHV), סוכן האטיולוגית הקשורים KS, וברור כי גורמים הסלולר חייב אינטראקציה עם גורמים ויראליים בתהליך של oncogenesis התקדמות הגידול. 6,7 זיהוי מארח גורם רומן הגורמים אשר תורמים KS הפתולוגיה חיונית לפיתוח סמנים פרוגנוסטיים להתקדמות גרורות הגידול, כמו גם לפיתוח הרפוי הרומן לטיפול KS . 8 הפרטים הווידאו המלווה את השיטות בהם אנו משתמשים כדי לזהות את התא המארח הגן ביטוי בתוכניות להשתנות עורי לתאי אנדותל כלי הדם (DMVEC) לאחר ההדבקה KSHV ועל רקמת הגידול KS. 9 לאחר גנים dysregulated מזוהים על ידי ניתוח microarray, שינויים בביטוי החלבונים הם אושר על ידי immunoblot ו immunofluorescence שכותרתו כפול. שינויים בביטוי של גנים תעתיק dysregulated הם אישרו במבחנה על ידי כמותי תגובה בזמן אמת שרשרת פולימרז (qRT-PCR). אימות של הממצאים במבחנה באמצעות ארכיוני KS רקמת הגידול מתבצע גם על ידי immunochemistry שכותרתו כפולה microarrays רקמות. 8,10 הגישה שלנו זיהוי גנים dysregulated ב microenvironment רקמת הגידול KS יאפשר פיתוח של במבחנה ולאחר מכן במערכות מודל עבור vivo גילוי והערכה של פוטנציאל טיפולית חדשנית לטיפול KS.
Protocol
Discussion
שיטות השתמשו בדוח זה יכול להתבצע במגוון רחב של הגדרות מעבדה. הם דורשים ציוד מיוחד או גישה למתקני הגרעין. אמצעי זהירות נאות יש לנקוט כאשר עושים ניסויים מעורבים גורמי מחלה ויראלית מדבקת כמו KSHV אשר עשויה לדרוש את השימוש ברמה biosaftey 3 (BSL-3) המתקנים. רכישות רקמות חייב להיות מ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ג'יימס EK הילדרת, Meharry Medical College, לעצתו וסקירה של כתב היד הזה. אנו מודים גם דיאנה Marver לעריכה של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי ונדרבילט Meharry המרכז לחקר האיידס (NIH מענק AI054999 P30-05); המרכז לחקר בריאות איידס פערים, NIH מענק 5U54 RR019192-05; Meharry המרכז למחקר קליני, NIH גרנט P20RR011792, ועל ידי NIH מענק P01 CA113239. DJA מומן בחלקו על ידי מענקים ממרכז טייס ואנדרבילט-Meharry לאיידס מחקר (כפר) והמרכז Meharry למחקר קליני (CRC).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 05-0001DJ | ||
| TPA | Sigma | P1585 | ||
| PBS pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | ||
| Sodium butyrate | Sigma | 19364 (FLUKA) | ||
| EBM-2 media | Lonza | CC-3156 | + bullet kits supplement | |
| DMVEC cells (HMVEC) | Lonza | CC2543 | ||
| Fetal calf serum | Hyclone | SH30066.03 | ||
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Chamber slides | Nalgene | 154461 | ||
| KSHV LANA Mab | Vector Labs | VP-H913 | 1:50 dilution/IFA | |
| Galectin-3 goat pAb | R&D Systems | AF1154 | ||
| Donkey-anti-goat FITC | Jackson ImmunoRessearch | 705-095-1 | ||
| Donkey-anti-goat Rho | Jackson ImmunoRessearch | 705-295-003 | 1:100 dilution/IFA | |
| Mounting media | Vector Labs | H 1500 | Vectashield with DAPI | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23235 | ||
| Nitrocellulose | Bio-Rad | 161-0112 | ||
| Donkey-anti-goat-conj. | Santa Cruz | SC 2020 | ||
| Western substrate | Pierce | 34075 | ||
| Biotin-rabbit-anti goat | DAKO | 305-065-045 | ||
| AP-Strepavidin conj. | DAKO | K 0492 (kit) | ||
| RNase DNase Free Set | Qiagen | 79254 | ||
| MJ Mini Cycler | Bio-Rad | PTC-1148C | ||
| Bio-Photometer | Eppendorf | 952000006 | ||
| RC 6 Plus Centrifuge | Sorvall | 46910 | ||
| Coulter Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman | 392052 | ||
| MYiQ iCycler Real Time PCR Detection System | Bio-Rad | 170-9770 | ||
| TE 2000S Fluorescent microscope | NIKON | TE2000S | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938C | ||
| Eclipse E 200 | NIKON | E 200 | ||
| Sorvall Legend RT Centrifuge | Thermo | 75004377 |
Referências
- Sitas, F., Newton, R. Kaposi’s sarcoma in South Africa. J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).
- Moore, P. S., Chang, Y., Knipe, D. M., Howley, P. M. Kaposi’s sarcoma associated herpesvirus. Field’s Virology. , 2803-2833 (2002).
- Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J., Knowles, D. M., Moore, P. S. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P., Said, J. W., Knowles, D. M., M, D. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N Engl J Med. 18, 1186-1191 (1995).
- Cesarman, E., Knowles, D. M. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus: a lymphotropic human herpesvirus associated with Kaposi’s sarcoma, primary effusion lymphoma, and multicentric Castleman’s disease. Semin Diagn Pathol. 14, 54-66 (1997).
- Chiou, C. J., Poole, L. J., Kim, P. S., Ciufo, D. M., Cannon, J. S., ap Rhys, C. M., Alcendor, D. J., Zong, J. C., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. J Virol. 76, 3421-3439 (2002).
- Staskus, K. A., Zhong, W., Gebhard, K., Herndier, B., Wang, H., Renne, R., Beneke, J., Pudney, J., Anderson, D. J., Ganem, D., Haase, A. T., T, A. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus gene expression in endothelial (spindle) tumor cells. J Virol. 71, 715-719 (1997).
- Alcendor, D. J., Zhu, W. Q., Desai, P., Vigil, H. E., Hayward, G. S. KSHV downregulation of galectin-3 in kaposi’s sarcoma. Glycobiology. , (2009).
- Ciufo, D. M., Cannon, J. S., Poole, L. J., Wu, F. Y., Murray, P., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Spindle cell conversion by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus: formation of colonies and plaques with mixed lytic and latent gene expression in infected primary dermal microvascular endothelial cell cultures. J Virol. 75, 5614-5626 (2001).
- Long, E., Ilie, M., Hofman, V., Havet, K., Selva, E., Butori, C., Lacour, J. P., Nelson, A. M., Cathomas, G., Hofman, P. LANA-1, Bcl-2, Mcl-1 and HIF-1alpha protein expression in HIV-associated Kaposi sarcoma. Virchows Arch. 2, 159-170 (2009).
