Vergelijkende In vivo Studie van gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis</em
Summary
De kikker<em> Xenopus laevis</em> Biedt een aantrekkelijk alternatief voor niet-zoogdieren model voor het verkennen van de mogelijkheid van heat shock protein, zoals gp96 om antigeen-specifieke CD8 T-cel responsen te bevorderen. We huidige methoden om te studeren<em> In vivo</em> Faciliteren van cross-presentatie van de huid en tumor antigenen door gp96.
Abstract
We hebben ontwikkeld in de amfibie Xenopus laevis een unieke niet-zoogdieren model om het vermogen van bepaalde heat shock eiwitten (HSP's) zoals gp96 om cross-presentatie van begeleid antigenen te vergemakkelijken en ontlokken aangeboren en adaptieve T-cel responsen. Xenopus huid afstoting van het transplantaat studie biedt een uitstekend platform om het vermogen van gp96 naar klassieke MHC klasse Ia (klasse Ia) beperkt T-cel reacties uitlokken te bestuderen. Daarnaast is de Xenopus model biedt ook een aantrekkelijk alternatief voor muizen voor het verkennen van de mogelijkheid van gp96 om reacties te genereren tegen tumoren die zijn down-gereguleerd hun klasse Ia moleculen zo te ontsnappen immuun surveillance. Onlangs hebben we een adoptieve overdracht van cel-test in Xenopus klonen met behulp van peritoneale leukocyten als antigeen presenterende cellen (APC's), en laten zien dat gp96 kan premier CD8 T-cel responsen in vivo tegen kleine histocompatibility huid antigenen als tegen de Xenopus thymus tumor 15 / 0 dat niet uitdrukken klasse Ia moleculen. We beschrijven hier de methodologie die betrokken zijn bij deze proeven, waaronder de elicitatie, pulseren en adoptieve overdracht van peritoneale leukocyten, evenals de huidtransplantatie en tumor transplantatie assays uit te voeren. Daarnaast zijn we ook het beschrijven van de oogst en de scheiding van perifeer bloed leukocyten gebruikt voor flowcytometrie en proliferatie assays die het mogelijk maken voor de verdere karakterisering van de effector bevolkingen die betrokken zijn bij de huid afwijzing en anti-tumor respons.
Protocol
Discussion
De amfibie Xenopus is een uniek veelzijdige niet-zoogdieren model om immuniteit te bestuderen. Het uitgebreide gebruik in de biomedische en immunologisch onderzoek heeft opgeleverd in vele belangrijke research tools, zoals de MHC gedefinieerd klonen LG-6 en LG-15, evenals verschillende cellijnen en monoklonale antilichamen. Met behulp van deze tools hebben we verschillende opgericht in vitro pt in vivo testen om de mogelijkheid van heat shock eiwitten zoals gp96 aan krachtige Ag-specifieke ant…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De deskundige veeteelt verstrekt door Tina Martin en David Albright is erg gewaardeerd. Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies T32-AI-07285 (HN), NIH R25 2GM064133 (TCL), 1R03-HD061671-01, R24-AI-059830-06 van de NIH.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Reagents needed: | ||||
| Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS): | ||||
| NaCl, 1.15 g/L | ||||
| Na2HPO4, 0.2 g/L | ||||
| KH2PO | ||||
| 10N NaOH | ||||
| Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222) | Crescent Research Chemicals | CAS#886-86-2 | ||
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S-233-500 | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | 100ml | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | ||
| Culture medium for Xenopus 15/0 tumors [see 3 for more details]: | ||||
| Iscove DMEM basal medium | Gibco-Invitrogen | 11965 | ||
| Insulin | ||||
| Non-essential amino acids | ||||
| Penicillin-streptomycin | ||||
| Kanamycin | ||||
| Primatone | Sheffield Products Division | |||
| β2-mercaptoethanol | ||||
| NaHCO3 | ||||
| 30% double distilled water | ||||
| 5% featal bovine serum | ||||
| 20% superantant from a Xenopus kidney cell line A6 | ||||
| 0.25% of normal Xenopus serum | ||||
| Materials and Equipment: | ||||
| 50 and 15 ml conical centrifuge tubes (sterile) | ||||
| 25 gauge 5/8 Precision Glide sterile needles | BD | |||
| 18 gauge 1½ Precision Glide sterile needles | BD | |||
| 1 ml Tuberculin Slip Tip Syringe sterile | BD | |||
| 10 ml Slip Tip Syringe sterile | BD | |||
| 1.5 ml MicroCentrifuge tubes (sterile) | ||||
| 60 X 15 mm Polystyrene Petri Dishes sterile | Falcon | |||
| Razor blades | ||||
| 25 X 75 mm X 1 mm Premium Microscope Slides | Fisher Scientific | |||
| 10 cm glass petri dishes | ||||
| 9″ Pasteur Pipetes Durex Borosilicate Glass Cotton Plugged Disposable | VWR | |||
| Tygon tubing | ||||
| Two # 5 Swiss Jeweler’s Forceps | Miltex Inc. | |||
| Micro Dissecting Spring Scissors McPherson-Vannas straight cutting edge 6 mm | Roboz | |||
| Helios calipers | ||||
| Dissecting microscope | ||||
| High intensity illuminator | ||||
| Hemacytometer | ||||
| Un-bunsen burner | ||||
| 37°C shaking incubator | ||||
| Centrifuge |
Referências
- Kobel, H. R., Pasquier, D. u., L, . Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus. Nature. 279, 157-158 (1979).
- Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the chaperones gp96 and hsp70. Eur J Immunol. 31, 186-195 (2001).
- Robert, J., Gantress, J., Cohen, N., Maniero, G. D. Xenopus as an experimental model for studying evolution of hsp–immune system interactions. Methods. 32, 42-53 (2004).
- Chardonnens, X., Pasquier, D. u., L, . Induction of skin allograft tolerance during metamorphosis of the toad Xenopus laevis: a possible model for studying generation of self tolerance to histocompatibility antigens. Eur J Immunol. 3, 569-573 (1973).
- Du Pasquier, L., Bernard, C. C. Active suppression of the allogeneic histocompatibility reactions during the metamorphosis of the clawed toad Xenopus. Differentiation. 16, 1-7 (1980).
- Ramanayake, T., Simon, D. A., Frelinger, J. G., Lord, E. M., Robert, J. In vivo study of T-cell responses to skin alloantigens in Xenopus using a novel whole-mount immunohistology method. Transplantation. 83, 159-166 (2007).
- Robert, J., Ramanayake, T., Maniero, G. D., Morales, H., Chida, A. S., S, A. Phylogenetic conservation of glycoprotein 96 ability to interact with CD91 and facilitate antigen cross-presentation. J Immunol. 180, 3176-3182 (2008).
- Robert, J., Gantress, J., Rau, L., Bell, A., Cohen, N. Minor histocompatibility antigen-specific MHC-restricted CD8 T cell responses elicited by heat shock proteins. J Immunol. 168, 1697-1703 (2002).
- Morales, H., Robert, J. In vivo and in vitro techniques for comparative study of antiviral T-cell responses in the amphibian Xenopus. Biol Proced Online. 10, 1-8 (2008).
- Maniero, G. D., Robert, J. Phylogenetic conservation of gp96-mediated antigen-specific cellular immunity: new evidence from adoptive cell transfer in xenopus. Transplantation. 78, 1415-1421 (2004).
