יחסי In vivo לימוד Adjuvanticity gp96 ב הצפרדע Xenopus laevis</em
Summary
הצפרדע<em> Xenopus laevis</em> מספק מודל אטרקטיבי חלופי שאינו לחקר יונקים את היכולת של חלבון הלם חום כגון gp96 לקדם אנטיגן ספציפי CD8 T התגובות התא. אנו מציגים שיטות מחקר<em> In vivo</em> סיוע של המצגת הנגדית של אנטיגנים סרטניים בעור על ידי gp96.
Abstract
פיתחנו את Xenopus דוחי laevis מודל ייחודי שאינם יונקים ללמוד את היכולת של חלבונים מסוימים הלם חום (hsps) כגון gp96 כדי להקל צולבות הצגת אנטיגנים מלווה ומעוררים מולד אדפטיבית התגובות תא T. Xenopus דחיית שתל עור מספק פלטפורמה מצוינת ללמוד את היכולת של gp96 לעורר קלאסית MHC בכיתה Ia (Ia בכיתה) מוגבלת התגובות תא T. בנוסף, מערכת מודל Xenopus גם מספק חלופה אטרקטיבית כדי עכברים לחקור את היכולת של gp96 ליצור תגובות נגד גידולים יש למטה מוסדר בכיתה Ia שלהם מולקולות ובכך להימלט מעקב החיסונית. לאחרונה, פיתחנו תא המאמצת להעביר assay ב Xenopus באמצעות שיבוטים leukocytes הצפק כמו תאים הצגת אנטיגן (נגמ"שים), וכן הראו כי gp96 יכולה הממשלה CD8 T התגובות תא in vivo נגד אנטיגנים עור קלים histocompatibility כמו גם נגד הגידול Xenopus הרתי 15 / 0 זה לא להביע Ia מולקולות בכיתה. אנו מתארים כאן את המתודולוגיה המעורבים לבצע את מבחני לרבות העברה, התמחרות פועם המאמצת של לויקוציטים הצפק, וכן השתלת עור מבחני השתלת הגידול. בנוסף אנחנו גם המתאר את קצירת והפרדה של לויקוציטים דם היקפיים המשמשים cytometry זרימה מבחני התפשטות המאפשרים אפיון נוסף של אוכלוסיות מעורבות מפעיל דחייה העור אנטי הגידול התגובות.
Protocol
Discussion
Xenopus דוחי הוא מודל ייחודי צדדי שאינם יונקים ללמוד חסינות. השימוש הנרחב שלה מחקר ביו החיסונית הניב רבות כלי מחקר חשוב כמו שיבוטים MHC מוגדר LG-6 ו-LG-15 וכן שורות תאים שונות נוגדנים חד שבטיים. השימוש בכלים אלו הקמנו שונים במבחנה מבחני vivo ללמוד את היכולת של הלם ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
חיה המומחה בעלי מסופק על ידי טינה מרטין דייוויד אולברייט מוערכת בהכרת תודה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים T32-AI-07285 (ח"נ), NIH R25 2GM064133 (TCL), 1R03-HD061671-01, R24-AI-059830-06 מ-NIH.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Reagents needed: | ||||
| Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS): | ||||
| NaCl, 1.15 g/L | ||||
| Na2HPO4, 0.2 g/L | ||||
| KH2PO | ||||
| 10N NaOH | ||||
| Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222) | Crescent Research Chemicals | CAS#886-86-2 | ||
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S-233-500 | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | 100ml | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | ||
| Culture medium for Xenopus 15/0 tumors [see 3 for more details]: | ||||
| Iscove DMEM basal medium | Gibco-Invitrogen | 11965 | ||
| Insulin | ||||
| Non-essential amino acids | ||||
| Penicillin-streptomycin | ||||
| Kanamycin | ||||
| Primatone | Sheffield Products Division | |||
| β2-mercaptoethanol | ||||
| NaHCO3 | ||||
| 30% double distilled water | ||||
| 5% featal bovine serum | ||||
| 20% superantant from a Xenopus kidney cell line A6 | ||||
| 0.25% of normal Xenopus serum | ||||
| Materials and Equipment: | ||||
| 50 and 15 ml conical centrifuge tubes (sterile) | ||||
| 25 gauge 5/8 Precision Glide sterile needles | BD | |||
| 18 gauge 1½ Precision Glide sterile needles | BD | |||
| 1 ml Tuberculin Slip Tip Syringe sterile | BD | |||
| 10 ml Slip Tip Syringe sterile | BD | |||
| 1.5 ml MicroCentrifuge tubes (sterile) | ||||
| 60 X 15 mm Polystyrene Petri Dishes sterile | Falcon | |||
| Razor blades | ||||
| 25 X 75 mm X 1 mm Premium Microscope Slides | Fisher Scientific | |||
| 10 cm glass petri dishes | ||||
| 9″ Pasteur Pipetes Durex Borosilicate Glass Cotton Plugged Disposable | VWR | |||
| Tygon tubing | ||||
| Two # 5 Swiss Jeweler’s Forceps | Miltex Inc. | |||
| Micro Dissecting Spring Scissors McPherson-Vannas straight cutting edge 6 mm | Roboz | |||
| Helios calipers | ||||
| Dissecting microscope | ||||
| High intensity illuminator | ||||
| Hemacytometer | ||||
| Un-bunsen burner | ||||
| 37°C shaking incubator | ||||
| Centrifuge |
Referências
- Kobel, H. R., Pasquier, D. u., L, . Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus. Nature. 279, 157-158 (1979).
- Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the chaperones gp96 and hsp70. Eur J Immunol. 31, 186-195 (2001).
- Robert, J., Gantress, J., Cohen, N., Maniero, G. D. Xenopus as an experimental model for studying evolution of hsp–immune system interactions. Methods. 32, 42-53 (2004).
- Chardonnens, X., Pasquier, D. u., L, . Induction of skin allograft tolerance during metamorphosis of the toad Xenopus laevis: a possible model for studying generation of self tolerance to histocompatibility antigens. Eur J Immunol. 3, 569-573 (1973).
- Du Pasquier, L., Bernard, C. C. Active suppression of the allogeneic histocompatibility reactions during the metamorphosis of the clawed toad Xenopus. Differentiation. 16, 1-7 (1980).
- Ramanayake, T., Simon, D. A., Frelinger, J. G., Lord, E. M., Robert, J. In vivo study of T-cell responses to skin alloantigens in Xenopus using a novel whole-mount immunohistology method. Transplantation. 83, 159-166 (2007).
- Robert, J., Ramanayake, T., Maniero, G. D., Morales, H., Chida, A. S., S, A. Phylogenetic conservation of glycoprotein 96 ability to interact with CD91 and facilitate antigen cross-presentation. J Immunol. 180, 3176-3182 (2008).
- Robert, J., Gantress, J., Rau, L., Bell, A., Cohen, N. Minor histocompatibility antigen-specific MHC-restricted CD8 T cell responses elicited by heat shock proteins. J Immunol. 168, 1697-1703 (2002).
- Morales, H., Robert, J. In vivo and in vitro techniques for comparative study of antiviral T-cell responses in the amphibian Xenopus. Biol Proced Online. 10, 1-8 (2008).
- Maniero, G. D., Robert, J. Phylogenetic conservation of gp96-mediated antigen-specific cellular immunity: new evidence from adoptive cell transfer in xenopus. Transplantation. 78, 1415-1421 (2004).
