比較 in vivoで研究アフリカツメガエル</em
Summary
カエル<em>アフリカツメガエル</em>抗原特異的CD8 T細胞応答を促進するようなgp96などの熱ショック蛋白質の能力を探索するための魅力的な代替の非哺乳類モデルを提供します。私たちは、勉強する方法を提示<em> in vivoで</emgp96による皮膚と腫瘍抗原のクロスプレゼンテーションの>促進。
Abstract
私たちは、両生類のアフリカツメガエルが chaperoned抗原のクロスプレゼンテーションを容易にし、自然免疫と獲得T細胞応答を誘発するようなgp96などの特定の熱ショックタンパク質（hsps）の能力を研究するために独自の非哺乳類モデルをアフリカツメガエル 。 ツメガエルの皮膚移植片の拒絶反応で開発している古典的MHCクラスIa（クラスⅠa）拘束性T細胞応答を惹起するgp96の能力を研究するための優れたプラットフォームを提供します。さらに、 アフリカツメガエルのモデルシステムはまた、それによって免疫監視を逃れるそれらのクラスIa分子をダウンレギュレートしている腫瘍に対して応答を生成するgp96の能力を探索するためのマウスに魅力的な代替手段を提供します。最近、我々は、抗原提示細胞（APC）として腹膜白血球を使用したアフリカツメガエルのクローンの養子セル転送アッセイを開発し、gp96が素数CD8 T細胞応答は、マイナー組織適合皮膚抗原に対するin vivoでだけでなく、 アフリカツメガエル胸腺の腫瘍15に対してできることが示されているクラスIa分子を発現していない/ 0。ここでは、腹膜白血球の誘発、パルスと養子移入だけでなく、皮膚移植と腫瘍移植アッセイを含むこれらのアッセイを行うために関係する方法論を説明します。さらに我々はまた、皮膚の拒絶反応と抗腫瘍応答に関与するエフェクター集団のさらなる特徴付けを可能にするフローサイトメトリーおよび増殖アッセイのために使用される末梢血白血球の収穫と分離して記述されています。
Protocol
Discussion
両生類のアフリカツメガエルは、免疫を研究するユニークな多用途の非哺乳類モデルです。生物医学と免疫学的研究におけるその広範な使用は、このようなMHC定義されているクローンLG – 6とLG – 15だけでなく、さまざまな細胞株とモノクローナル抗体などの多くの重要な研究ツールで得られている。我々は強力なのAg特異的抗マイナーH – Agおよび抗腫瘍T細胞応答7を仲介するよう…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ティナマーティンとデビッドオルブライトが提供する専門の動物の飼育は感謝感謝です。この研究はNIHからの補助金T32 – AI – 07285（HN）、NIH R25 2GM064133（TCL）、1R03 – HD061671 – 01、R24 – AI – 059830〜06によってサポートされていました。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Reagents needed: | ||||
| Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS): | ||||
| NaCl, 1.15 g/L | ||||
| Na2HPO4, 0.2 g/L | ||||
| KH2PO | ||||
| 10N NaOH | ||||
| Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222) | Crescent Research Chemicals | CAS#886-86-2 | ||
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S-233-500 | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | 100ml | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | ||
| Culture medium for Xenopus 15/0 tumors [see 3 for more details]: | ||||
| Iscove DMEM basal medium | Gibco-Invitrogen | 11965 | ||
| Insulin | ||||
| Non-essential amino acids | ||||
| Penicillin-streptomycin | ||||
| Kanamycin | ||||
| Primatone | Sheffield Products Division | |||
| β2-mercaptoethanol | ||||
| NaHCO3 | ||||
| 30% double distilled water | ||||
| 5% featal bovine serum | ||||
| 20% superantant from a Xenopus kidney cell line A6 | ||||
| 0.25% of normal Xenopus serum | ||||
| Materials and Equipment: | ||||
| 50 and 15 ml conical centrifuge tubes (sterile) | ||||
| 25 gauge 5/8 Precision Glide sterile needles | BD | |||
| 18 gauge 1½ Precision Glide sterile needles | BD | |||
| 1 ml Tuberculin Slip Tip Syringe sterile | BD | |||
| 10 ml Slip Tip Syringe sterile | BD | |||
| 1.5 ml MicroCentrifuge tubes (sterile) | ||||
| 60 X 15 mm Polystyrene Petri Dishes sterile | Falcon | |||
| Razor blades | ||||
| 25 X 75 mm X 1 mm Premium Microscope Slides | Fisher Scientific | |||
| 10 cm glass petri dishes | ||||
| 9″ Pasteur Pipetes Durex Borosilicate Glass Cotton Plugged Disposable | VWR | |||
| Tygon tubing | ||||
| Two # 5 Swiss Jeweler’s Forceps | Miltex Inc. | |||
| Micro Dissecting Spring Scissors McPherson-Vannas straight cutting edge 6 mm | Roboz | |||
| Helios calipers | ||||
| Dissecting microscope | ||||
| High intensity illuminator | ||||
| Hemacytometer | ||||
| Un-bunsen burner | ||||
| 37°C shaking incubator | ||||
| Centrifuge |
Referências
- Kobel, H. R., Pasquier, D. u., L, . Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus. Nature. 279, 157-158 (1979).
- Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the chaperones gp96 and hsp70. Eur J Immunol. 31, 186-195 (2001).
- Robert, J., Gantress, J., Cohen, N., Maniero, G. D. Xenopus as an experimental model for studying evolution of hsp–immune system interactions. Methods. 32, 42-53 (2004).
- Chardonnens, X., Pasquier, D. u., L, . Induction of skin allograft tolerance during metamorphosis of the toad Xenopus laevis: a possible model for studying generation of self tolerance to histocompatibility antigens. Eur J Immunol. 3, 569-573 (1973).
- Du Pasquier, L., Bernard, C. C. Active suppression of the allogeneic histocompatibility reactions during the metamorphosis of the clawed toad Xenopus. Differentiation. 16, 1-7 (1980).
- Ramanayake, T., Simon, D. A., Frelinger, J. G., Lord, E. M., Robert, J. In vivo study of T-cell responses to skin alloantigens in Xenopus using a novel whole-mount immunohistology method. Transplantation. 83, 159-166 (2007).
- Robert, J., Ramanayake, T., Maniero, G. D., Morales, H., Chida, A. S., S, A. Phylogenetic conservation of glycoprotein 96 ability to interact with CD91 and facilitate antigen cross-presentation. J Immunol. 180, 3176-3182 (2008).
- Robert, J., Gantress, J., Rau, L., Bell, A., Cohen, N. Minor histocompatibility antigen-specific MHC-restricted CD8 T cell responses elicited by heat shock proteins. J Immunol. 168, 1697-1703 (2002).
- Morales, H., Robert, J. In vivo and in vitro techniques for comparative study of antiviral T-cell responses in the amphibian Xenopus. Biol Proced Online. 10, 1-8 (2008).
- Maniero, G. D., Robert, J. Phylogenetic conservation of gp96-mediated antigen-specific cellular immunity: new evidence from adoptive cell transfer in xenopus. Transplantation. 78, 1415-1421 (2004).
