Genomik Modifikasyonların Taranması: Drosophila'da CRISPR Tarafından Üretilen Mutantları Tanımlama Yöntemi

Published: April 30, 2023

Abstract

Kaynak: Du, L., vd. Genom Düzenleme ile Drosophila’da Dokuya Özgü İkili Transkripsiyon Sistemleri Üretmek için Verimli Bir Strateji. J. Vis. Exp. (2018).

Bu videoda, genomu CRISPR-Cas9 kullanılarak değiştirilen transgenik Drosophila sineklerini tanımlamak için bir tarama yöntemi açıklanmaktadır. CRISPR-Cas9, bilim adamlarının bir organizmanın genomunu manipüle etme biçiminde devrim yapan güçlü bir genom düzenleme aracıdır. Örnek protokolde, bir transaktivasyon dizisinin eklenmesinin dalsız (bnl) genin ilk eksonunun yerini aldığı CRISPR tarafından oluşturulan mutantların nasıl tanımlanacağını göreceğiz, böylece bnl gene özgü bir sürücü hattı olan bnl-LexA.

Protocol

Bu protokol, Genom Düzenleme, J. Vis. Exp. (2018) tarafından Drosophila’da Dokuya Özgü İkili Transkripsiyon Sistemleri Üretmek için Etkili Bir Strateji olan Du ve ark.’danbir alıntıdır. 1. Sinek genetiği ve taraması (Şekil 1 ve Şekil 2) Enjekte edilen embriyolar yetişkinlere dönüştüğünde, dengeleyici sineklere her bir G0 sinekini geçin. Hedeflenen aleleyi içeren kromozom için uygun dengeleyiciyi seçin. Her G0 ç…

Representative Results

Şekil 1: İkili transkripsiyon sistemi oluşturmak için CRISPR/Cas9 aracılı genom düzenleme iş akışına genel bakış. Her adım için gereken yaklaşık süre belirtilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. <img alt="Figure 2" class="xfigim…

Materials

Tris-HCl Sigma Aldrich T3253 Biologia Molecular
EDTA Sigma Aldrich E1161 Biologia Molecular
NaCl Sigma Aldrich S7653 Biologia Molecular
UltraPure DNase/RNase-Free Water ThermoFisher Scientific 10977-023 Biologia Molecular
Primers IDT-DNA PCR
Proteinase K ThermoFisher Scientific 25530049 Biologia Molecular
2x PCR PreMix, with dye (red) Sydlab MB067-EQ2R Biologia Molecular
MKRS/TB6B Kornberg lab Fly line
CO2 station Genesee Scientific 59-122WCU fly pushing
Stereo microscope Olympus SZ-61 fly pushing
Microtube homogenizing pestles Fisher-Scientific 03-421-217 genomic DNA isolation

Play Video

Citar este artigo
Screening for Genomic Modifications: A Method to Identify CRISPR-Generated Mutants in Drosophila. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20110, doi: (2023).

View Video