Summary

Single Sensillum Opnamen in de Insecten Drosophila melanogaster En Anopheles gambiae</em

Published: February 17, 2010
doi:

Summary

Elektrofysiologische reacties van olfactorische sensorische neuronen aan geurstoffen kan worden gemeten bij insecten met behulp van enkele sensillum opnames. In deze video artikel zullen we laten zien hoe je een sensillum opnamen in de antennes van de azijn fly uit te voeren (<em> Drosophila melanogaster</em>) En de maxillaire palpen van de malariamug (<em> Anopheles gambiae</em>).

Abstract

Het gevoel van geur is van essentieel belang voor insecten te vinden voedsel, partners, roofdieren, en ovipositie plaatsen 3. Insect olfactorische sensorische neuronen (OSNs) zijn ingesloten in de sensorische haren genaamd sensilla, die het oppervlak van de reukorganen te dekken. Het oppervlak van elk sensillum is bedekt met kleine poriën, waardoor geurstoffen passeren en oplossen in een vloeistof genaamd lymfe sensillum, die de sensorische dendrieten van de OSNs gehuisvest in een bepaalde sensillum baadt. De OSN dendrieten express geurstof receptor (OR) eiwitten, die bij insecten functioneren als geur-gated ionkanalen 4, 5. De interactie van geurstoffen met de OR of stijgingen of dalingen van de basale vuursnelheid van de OSN. Deze neuronale activiteit in de vorm van actiepotentialen belichaamt de eerste voorstelling van de kwaliteit, intensiteit, en temporele kenmerken van de geurstof 6, 7.

Gezien de gemakkelijke toegang tot deze zintuiglijke haren, is het mogelijk om extracellulaire opnames van enkele OSNs uit te voeren door de invoering van een registratie-elektrode in de sensillum lymfe, terwijl de referentie-elektrode wordt geplaatst in de lymfe van het oog of het lichaam van het insect. In Drosophila, sensilla huis tussen een en vier OSNs, maar elke OSN geeft meestal een karakteristieke piek amplitude. Spike sorteer-technieken maken het mogelijk om stekelige reacties toewijzen aan de individuele OSNs. Deze single sensillum opname (SSR) techniek bewaakt het verschil in potentiaal tussen de sensillum lymfe en de referentie-elektrode als elektrische pieken die worden gegenereerd door de receptor activiteit op OSNs 1, 2, 8. Veranderingen in het aantal pieken in reactie op de geurstof vertegenwoordigen de cellulaire basis van geur codering bij insecten. We beschrijven hier de bereidingswijze die momenteel worden gebruikt in ons lab te SSR te voeren op Drosophila melanogaster pt Anopheles gambiae, en laten zien vertegenwoordiger sporen geïnduceerd door de geurstoffen in een sensillum-specifieke wijze.

Protocol

1. Geur verdunningen De meeste geurstoffen zijn oplosbaar in paraffine olie. Echter, DMSO of ethanol ook worden gebruikt als alternatief oplosmiddel voor bepaalde geuren. Bereid geschikte verdunningen (bijv. 1:10 volume: volume, v: v) uit zuivere geurstoffen in glazen flesjes. De meeste geur verdunningen zijn stabiel bij kamertemperatuur, maar voor zeer vluchtige stoffen is het beter te werken verdunningen te maken op een wekelijkse basis. Elke sensillum reageert op de verschillende geuren in een andere conce…

Discussion

Olfactorische signalen worden gebruikt door organismen aan voedsel bronnen, mogelijke partners, en roofdieren te identificeren. Olfactorische sensorische neuronen (OSNs) zijn de eerste relais midden tussen externe stimuli en de hogere centra van de hersenen waar de informatie verder wordt verwerkt. In Drosophila melanogaster pt Anopheles gambiae, OSNs zijn gemakkelijk bereikbaar en hun elektrische activiteit kan worden gecontroleerd, terwijl gestimuleerd door geur trekjes.

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue Number Comment
Paraffin oil Odors Fluka 76235  
High purity odors (>98%) Odors Sigma-Aldrich   Methyl acetate
#296996
1-octen-3-ol
#74950
Filter paper strips Odors Fisherbrand 05-714-1 Chromatography paper
Connectors Odors Cole-Parmer EW-06365-40 1/16×1/8″
Glass vials Odors Agilent Technologies 5182-0556  
Air line plastic tubing Odor Delivery Python Products 500PAL  
1 serological pipette Odor Delivery Corning 4101 10 mL
Plastic tubing Odor Delivery Cole-Parmer EW-06418-0 0.050″x0.090″OD
Disposable borosilicate glass Pasteur pipettes Odor Delivery FisherBrand 13-678-20A 5-3/4 inches
Programmable stimulus controller Odor Delivery Syntech CS-55  
Anti-vibration table Electrophysiology Equipment TMC 63533 36”Wx30”Dx29”H
Faraday cage Electrophysiology Equipment TMC MI8133303  
Inverted microscope Electrophysiology Equipment Nikon E600FN ECLIPSE Recording microscope
10x and 100x objectives Electrophysiology Equipment Nikon 10x Plan Fluor 100x L Plan  
Dissecting microscope Electrophysiology Equipment Nikon EZ645 electrode sharpening/insect prep microscope
Magnetic stands Electrophysiology Equipment Newport MODEL 150  
IDAC Electrophysiology Equipment Syntech IDAC-4  
Acquisition software Electrophysiology Equipment Syntech Autospike  
1 macromanipulator Electrophysiology Equipment NARISHIGE MN-151 Joystick manipulator
Used for positioning reference electrode
1 micromanipulator Electrophysiology Equipment EXFO PCS-6000 Used for positioning recording electrode
Crocodile clip Electrophysiology Equipment Pomona AL-B-12-0  
Electric cable Electrophysiology Equipment Pomona B-36-0 Test Cable Assembly
2 electrode holders Electrophysiology Equipment Syntech N/A Electrode holders (set of 2) for tungsten wire electrode
AC probe Electrophysiology Equipment Syntech N/A Universal single ended probe (10xAC)
Tungsten electrodes Electrophysiology Equipment Microprobes M210 straight tungsten rods, 0.005“x3“
Potassium hydroxide Electrophysiology Equipment Sigma-Aldrich 221473  
Syringe Electrophysiology Equipment BD 301625 20 mL
Power supply Electrophysiology Equipment WILD HEERBRUGG 6V 40W e.g MTR32  
Vertical puller Insect prep Narishige PB-7  
Razor blade Insect prep VWR 55411-050  
Dental wax Insect prep Patterson 091-1503  
Microscope slide Insect prep FisherBrand 12-550A  
Cover glass Insect prep FisherBrand 12-541A 18X18 #1.5
Polypropylene mesh Insect prep Small Parts inc. CMP-0500-B  
Glass electrode Insect prep Frederick Haer & Co. 27-32-0-075 Capillary tubing borosilicate 1.5mm OD x 1.12mm ID x 75 mm
Double-sided tape (3M) Insect prep 3M MMM6652P3436 Double-sided tape (3M)
Forceps Insect prep Fine Science Tools 021×0053 Dumont #5 Mirror Finish Forceps
Small plastic cup Insect prep VWR 89009-662 7 x 5.7 (23/4 x 21/4)
Electric aspirator Insect prep Gempler’s RHM200  

Referências

  1. Boeckh, J. Elektrophysiologische Untersuchungen an einzelnen Geruchsrezeptoren auf der Antenne des TotengrAbers (Necrophorus Coleoptera). Z. Vergl. Physiol. 46, 212-248 (1962).
  2. Schneider, D., Hecker, E. Zur Elektrophysiologic der Antenne des Seidenspinners Bombyx mori bei Reizung mit angereicherten Extrakten des Sexuallockstoffes. Z. Naturforschg. 11b, 121-124 (1956).
  3. Touhara, K., Vosshall, L. B. Sensing odorants and pheromones with chemosensory receptors. Annu Rev Physiol. 71, 307-332 (2009).
  4. Sato, K. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452, 1002-1006 (2008).
  5. Wicher, D. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452, 1007-1011 (2008).
  6. Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117, 965-979 (2004).
  7. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
  8. Boeckh, J., Kaissling, K. E., Schneider, D. Insect olfactory receptors. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 30, 263-280 (1965).
  9. de Bruyne, M., Foster, K., Carlson, J. R. Odor coding in the Drosophila antenna. Neuron. 30, 537-552 (2001).
  10. Lu, T. Odor coding in the maxillary palp of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Curr Biol. 17, 1533-1544 (2007).
  11. Hallem, E. A., Fox, A. N., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Olfaction: mosquito receptor for human-sweat odorant. Nature. 427, 212-213 (2004).
  12. Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. J. M. o. l. e. c. u. l. a. r. anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Curr. Biol. 15, 1535-1547 (2005).
  13. Fishilevich, E., Vosshall, L. B. Genetic and functional subdivision of the Drosophila antennal lobe. Curr Biol. 15, 1548-1553 (2005).

Play Video

Citar este artigo
Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. (36), e1725, doi:10.3791/1725 (2010).

View Video