Vi leverer en detaljeret protokol til et allestedsnærværende assay af et specifikt substrat og en E3 ubiquitin-ligase i pattedyrceller. HEK293T-cellelinjer blev anvendt til proteinoverekspression, det polyubiquitylerede substrat blev oprenset fra cellelysater ved immunoprecipitation og løst i SDS-PAGE. Immunoblotting blev brugt til at visualisere denne posttranslationelle modifikation.