Generasjon av primære mammospheres: En teknikk for å bestemme cellestyrke

En enkelt brystkreft stamcelle gir opphav til en klynge av celler kalt en primær mammosphere. For å få dem, først kultur en brystkreft celle linje til 70% til 80% confluent, for å sikre at cellene er i vekstfasen. Legg Tripsin-EDTA for å løsne celler fra kolben, og legg til et medium med serum for å stoppe handlingen til Tripsin.

Ta cellene i et rør og sentrifuger for å få cellepellet. Resuspend pellet i mammosphere medium uten serum og passere suspensjonen gjennom en celle sil cap filter, for å få en enkelt celle suspensjon. Denne suspensjonen består av stamceller, stamceller og differensierte celler som viser forskjellige proteinuttrykk.

CD44 og CD24 er celleoverflateproteiner som er karakteristiske for brystkreft stamceller. De er positive for CD44-uttrykk og negative for CD24. Isoler celler fra celleopphenget ved hjelp av fluorescens eller magnetisk aktivert cellesortering. Deretter tar du en aliquot og annonse trypan blå flekk til cellene, og beregner antall levedyktige celler per milliliter ved hjelp av et hemocytometer lysbilde for å finne såddtettheten.

Til slutt frø cellene i en seks godt ultra lav tilhengerplate, slik at cellene forblir suspendert. Inkuber platen i 5 til 10 dager uten å forstyrre platen til sfærene er 40 mikron i diameter. I følgende protokoll vil vi generere primære mammospheres fra en brystkreftcellelinje.

- Arbeid under en steril kulturhette, start denne prosedyren med MCF7- eller MDA-MB-231-celler som er 70% til 80% konfluensa. Aspirer mediet fra kolben. Vask cellene to ganger med PBS, legg deretter til Tripsin-EDTA og inkuber i to til seks minutter. Etter løsrivelse, slukke ved å legge mammosphere medium som inneholder 10% FBS.

Når cellene har løsnet, overfør dem til et 15 milliliter konisk sentrifugerør og spinn det 200 ganger g ved romtemperatur i fem minutter. Etter denne sentrifugering dekantere supernatanten, deretter resuspended cellene i en til fem milliliter mammosphere medium. Pipette opp og ned 10 ganger for å bryte opp cellepellet.

Deretter overfører du celleopphenget til et 40 mikroncellestrekkende hettefilter og samler strømmen gjennom i det vedlagte røret for å oppnå en enkelt celleoppheng. Pipette en 20 mikroliter aliquot av de resuspenderte cellene på et hemocytometer og bruk et mikroskop for å undersøke det. Hvis celleklynger observeres som vist her, bruk en sprøyte til å besvime suspensjonen inn og ut av en 25 gauge nål en eller to ganger.

Når cellene har blitt spredt inn i en enkelt celle suspensjon som vist her, fortsett å isolere CD44 positiv, CD24 negative cellulære delsett via fluorescens aktivert celle sortering eller magnetisk aktivert celle sortering ved hjelp av LS-kolonne for å positivt velge CD44 positive celler. Siden de ønskede cellene festes til veggene i LS-kolonnen, kast gjennomstrømningen, fjern deretter celler fra kolonnen, bruk fem milliliter buffer og bruk og trykk stempelet som følger med kolonnen for å skylle ut de ønskede cellene.

Deretter bruker du en LD-kolonne til å rense populasjonen ytterligere ved negativ merking. Her festes DE positive CD24-cellene til LD-kolonnene. Samle gjennomflyten som inneholder CD24-negative celler. Deretter bekrefter bruk av strømningscytometri fenotypene til alle isolerte celler. Bruk den blå eksklusjonsmetoden trypanblå til å beregne tettheten til levedyktige celler.

Etter hensiktsmessig fortynning av celleopphenget, frø hver brønn av en seks brønn ultralow festeplate med 500 til 4000 celler per centimeter kvadrat i 2 milliliter komplett mammosphere medium. Inkuber platene og pass på at du ikke forstyrrer dem i 5 til 10 dager til sfærer blir observert. Fortsett å dyrke til kulene var minst 40 mikron i diameter, men har ennå ikke begynt å bli apoptotiske.