Generazione di mammosfere primarie: una tecnica per determinare la potenza cellulare

Una singola cellula staminante del cancro al seno dà origine a un gruppo di cellule chiamate mammosfera primaria. Per ottenerli, prima coltura una linea cellulare di cancro al seno fino al 70% all'80% confluente, per garantire che le cellule siano nella loro fase di crescita. Aggiungere Tripsin-EDTA per staccare le cellule dal pallone e aggiungere un mezzo con siero per interrompere l'azione di Tripsin.

Ora, prendi le cellule in un tubo e centrifuga per ottenere il pellet cellulare. Rimorsi il pellet nel mezzo mammosfera senza siero e passare la sospensione attraverso un filtro del tappo del filtro cellulare, per ottenere una singola sospensione cellulare. Questa sospensione è costituita da cellule staminali, cellule progenitrici e cellule differenziate che mostrano diverse espressioni proteiche.

CD44 e CD24 sono proteine di superficie cellulare caratteristiche delle cellule staminali del cancro al seno. Sono positivi per l'espressione CD44 e negativi per CD24. Isolare le cellule dalla sospensione cellulare utilizzando la fluorescenza o lo smistamento magnetico delle celle attivate. Quindi, prendere un'aliquota e ad trypan macchia blu alle cellule, e calcolare il numero di cellule vitali per millilitro usando una diapositiva emocitometro per trovare la densità di semina.

Infine, seminare le cellule in una piastra aderente ben ultra bassa, in modo che le cellule rimangano sospese. Incubare la piastra per 5-10 giorni senza disturbare la piastra fino a quando le sfere hanno un diametro di 40 micron. Nel seguente protocollo, genereremo mammosfere primarie da una linea cellulare per il cancro al seno.

- Lavorando sotto una cappa di coltura sterile, iniziare questa procedura con cellule MCF7 o MDA-MB-231 che sono dal 70% all'80% confluenti. Aspirare il mezzo dal pallone. Lavare le cellule due volte con PBS, quindi aggiungere Tripsin-EDTA e incubare per due o sei minuti. Dopo il distacco, dissetarsi aggiungendo un mezzo mammosfera contenente il 10% di FBS.

Una volta che le cellule si sono staccate, trasferirle in un tubo di centrifuga conico da 15 millilitri e ruotarlo 200 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti. A seguito di questa centrifugazione decantare il supernatante, quindi rimospendò le cellule in uno o cinque millilitri di mezzo mammosfera. Pipetta su e giù 10 volte per rompere il pellet cellulare.

Successivamente, trasferire la sospensione cellulare in un filtro del tappo filtrante a celle da 40 micron e raccogliere il flusso attraverso il tubo collegato per ottenere una sospensione a cella singola. Pipettare un'aliquota di 20 microliter delle cellule rimescolate su un emocitometro e utilizzare un microscopio per esaminarla. Se i cluster cellulari sono osservati come si vede qui, utilizzare una siringa per far passare la sospensione dentro e fuori da un ago calibro 25 una o due volte.

Una volta che le cellule sono state disperse in una singola sospensione cellulare come mostrato qui, procedere a isolare i sottoinsiemi cellulari positivi CD44 positivi CD24 negativi tramite smistamento delle celle attivato a fluorescenza o smistamento magnetico delle celle attivate utilizzando la colonna LS per selezionare positivamente le cellule positive CD44. Poiché le celle desiderate si attaccano alle pareti della colonna LS, scartare il flusso, quindi rimuovere le celle dalla colonna, applicare cinque millilitri di buffer e applicare e deprimere lo stantuffo fornito con la colonna per svuotare le celle desiderate.

Quindi, utilizzare una colonna LD per purificare ulteriormente la popolazione mediante selezione negativa. Qui, le celle positive cd24 si attaccano alle colonne LD. Raccogliere il flusso attraverso il quale contiene le celle negative CD24. Successivamente, l'uso della citometria a flusso conferma i fenotipi di tutte le cellule isolate. Utilizzando il metodo di esclusione blu del tripano, calcolare la densità delle cellule vitali.

Dopo aver diluito in modo appropriato la sospensione cellulare, seminare ogni pozzo di una piastra di attacco ben ultralow con da 500 a 4.000 celle per centimetro quadrato in 2 millilitri di mezzo mammosfera completo. Incubare le piastre facendo attenzione a non disturbarle per 5-10 giorni fino a quando non si osservano sfere. Continuare a coltivare fino a quando le sfere avevano un diametro di almeno 40 micron, ma non hanno ancora iniziato a diventare apoptotiche.