Retinal Organoidlerin Mikroglia ile Birleştirilmesi
Summary
Mikroglia, retinada bulunan benzersiz yerleşik bağışıklık hücreleridir ve çeşitli retinal dejeneratif hastalıklarda çok önemli roller oynar. Retinal organoidlerin mikroglia ile ko-kültür modelinin oluşturulması, retina hastalıklarının patogenezinin ve gelişim sürecinin daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırabilir.
Abstract
İnsan retinasının sınırlı erişilebilirliği nedeniyle, retina organoidleri (RO’lar), retina gelişim mekanizmasını ve retina hastalığının oluşumunu ortaya çıkarabilecek insan retina hastalığını incelemek için en iyi modeldir. Mikroglia (MG), retina ve merkezi sinir sisteminde (MSS) benzersiz yerleşik makrofajlardır ve önemli bağışıklık fonksiyonlarına hizmet eder. Bununla birlikte, retinal organoidler, farklılaşma kökenleri yumurta sarısı kesesi olduğu için mikrogliadan yoksundur. Bu retina hastalıklarında mikroglianın spesifik patogenezi belirsizliğini korumaktadır; Bu nedenle, mikroglia içeren bir retinal organoid modelinin kurulmasının gerekli olduğu ortaya çıkmaktadır. Burada, insan kök hücrelerinden türetilen mikroglia ile birlikte kültürlenmiş bir retinal organoid modelini başarıyla oluşturduk. Bu makalede, mikroglia ayrımı yapıldı ve daha sonra erken evrede retinal organoidlerle birlikte kültürlendi. Bağışıklık hücrelerinin dahil edilmesi olarak bu model, retina ve CNS ile ilişkili hastalıkların patogenezi ve tedavisi hakkında derinlemesine araştırmaları kolaylaştırmak için retina hastalığı modellemesi ve ilaç taraması için optimize edilmiş bir platform sağlar.
Introduction
İnsan retinasının sınırlı kaynağı olarak, insan kök hücrelerinin üç boyutlu (3D) retinal organoidlere farklılaşması, retinayı simüle etmek için umut verici bir in vitro modeli temsil eder1. Retinada fotoreseptörler, retinal ganglion hücreleri, bipolar hücreler, Müller hücreleri, yatay hücreler ve astrositler2 dahil olmak üzere farklı hücre tipleri içerir. Bu model, hem retina gelişim mekanizmalarının hem de retina hastalıklarının patogenezinin öykünmesini ve incelenmesini sağlar. Bununla birlikte, yönlü farklılaşma yöntemi nedeniyle, retinal organoidler, yolk kesesinden mikroglia ve mezodermden perivasküler hücreler gibi farklı germ katmanlarından kaynaklanan diğer birçok hücre tipinden yoksun olan nöroektoderm3’ten türetilmiştir 4,5,6.
Şu anda, retinitis pigmentosa7, glokom8 ve retinoblastoma9 gibi birçok retina hastalığının retinadaki mikroglia ile yakından ilişkili olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, uygun araştırma modellerinin olmaması nedeniyle, mikroglia ile bu hastalıklar arasındaki ilişkiyi gösteren spesifik mekanizmalar hala belirsizliğini korumaktadır. Fareler retina hastalıklarını incelemek için uygun bir model olarak hizmet ederken, son çalışmalar fare ve insan mikrogliası arasında yaşam süresi, proliferasyon oranı ve insan homolog genlerinin yokluğu açısından önemli farklılıklar olduğunu vurgulamıştır10,11. Bu bulgular, fare modellerinden elde edilen sonuçların tamamen güvenilir olmayabileceğini ve mikroglia içeren insan retinal organoidlerinin oluşturulmasının önemini vurguladığını öne sürdü.
Son birkaç on yılda, retinal organoidlerin 3 boyutlu farklılaşması için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir12,13. Retinal organoidler içinde mikroglia’nın ko-kültür çalışmasını kolaylaştırmak için, yapışık kültürden süspansiyon kültürüne geçişi içeren bir farklılaşma yöntemi seçtik. Bu yaklaşım, mikroglia’nın retinal organoidlere başarılı bir şekilde dahil edilmesini ve en az 60 gün boyunca korunmasını sağlar14.
Protocol
Representative Results
Discussion
İnsan retinasının sınırlı mevcudiyeti nedeniyle, retinal inflamatuar yanıtların mevcut anlayışı neredeyse hayvan modellerinden gelmektedir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için retinal organoidler farklılaştırıldı. Retinal organoid modellerin geliştirilmesi, hastalık modellemesi ve terapötik gelişim için insan retinasının karmaşıklığını özetlemeyi amaçlayan aktif bir araştırma alanı olmuştur. Birkaç çalışma, insan pluripotent kök hücrelerindenbaşarılı</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82101145) ve Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (Z200014) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Acctuase | Stemcell Technologies | 07920 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634-010 | |
| Anti-CRX(M02) | abnova | H00001406-M02 | Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions |
| Anti-IBA1 | Abcam | ab5076 | Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions |
| B27 | Life Technologies | 17105-041 | |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 07923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-042 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| FBS | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Gelatin | Sigma | G7041-100G | Solid |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| H9 cell line | WiCell Research Institute | ||
| IL-3 | RD Systems | 203-IL-050 | |
| IL-34 | PeproTech | 200-34-50UG | |
| KSR | Gibco | 10828028 | |
| Matrix | Corning | 356231 | |
| M-CSF | RD Systems | 216-MC-500 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution | Sigma | M7145 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Stem cell medium | Stemcell Technologies | 5990 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| X-ViVO | LONZA | 04-418Q | |
| Y27632 | Selleck | S1049 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 |
References
- Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640.e34 (2020).
- Zhang, X., Jin, Z. B. Directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells. J Vis Exp. (170), e62298 (2021).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via pu.1- and irf8-dependent pathways. Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- O’koren, E. G., et al. Microglial function is distinct in different anatomical locations during retinal homeostasis and degeneration. Immunity. 50 (3), 723-737.e7 (2019).
- Margeta, M. A., et al. Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma. Immunity. 55 (9), 1627-1644.e7 (2022).
- Xu, J., et al. Enhanced innate responses in microglia derived from retinoblastoma patient-specific IPSCs. Glia. 72 (5), 872-884 (2024).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), eaal3222 (2017).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nat Neurosci. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Gao, M. L., et al. Functional microglia derived from human pluripotent stem cells empower retinal organ. Sci China Life Sci. 65 (6), 1057-1071 (2022).
- Zhang, X., Jin, Z. B. Reconstruct human retinoblastoma in vitro. J Vis Exp. (188), e62629 (2022).
- Park, D. S., et al. IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer. Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).
- Usui-Ouchi, A., et al. Integrating human ipsc-derived macrophage progenitors into retinal organoids to generate a mature retinal microglial niche. Glia. 71 (10), 2372-2382 (2023).
- Chichagova, V., et al. Incorporating microglia-like cells in human induced pluripotent stem cell-derived retinal organoids. J Cell Mol Med. 27 (3), 435-445 (2023).
