Summary

Aislamiento de células inmunitarias del cerebro y el cráneo de ratones

Published: July 26, 2024
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Summary

Para investigar la respuesta inmunitaria a los trastornos cerebrales, un enfoque común es analizar los cambios en las células inmunitarias. Aquí, se proporcionan dos protocolos simples y efectivos para aislar células inmunitarias del tejido cerebral murino y la médula ósea del cráneo.

Abstract

Cada vez hay más pruebas de que la respuesta inmunitaria desencadenada por los trastornos cerebrales (por ejemplo, isquemia cerebral y encefalomielitis autoinmunitaria) no sólo se produce en el cerebro, sino también en el cráneo. Un paso clave para analizar los cambios en las poblaciones de células inmunitarias tanto en el cerebro como en la médula ósea del cráneo después de un daño cerebral (por ejemplo, un accidente cerebrovascular) es obtener un número suficiente de células inmunitarias de alta calidad para los análisis posteriores. Aquí, se proporcionan dos protocolos optimizados para aislar las células inmunitarias del cerebro y la médula ósea del cráneo. Las ventajas de ambos protocolos se reflejan en su simplicidad, rapidez y eficacia para producir una gran cantidad de células inmunitarias viables. Estas células pueden ser adecuadas para una serie de aplicaciones posteriores, como la clasificación de células, la citometría de flujo y el análisis transcriptómico. Para demostrar la eficacia de los protocolos, se realizaron experimentos de inmunofenotipado en cerebros de accidente cerebrovascular y médula ósea de cráneo normal mediante análisis de citometría de flujo, y los resultados se alinearon con los hallazgos de los estudios publicados.

Introduction

El cerebro, el eje central del sistema nervioso, está protegido por el cráneo. Debajo del cráneo hay tres capas de tejido conectivo conocido como meninges: la duramadre, la aracnoides y la piamadre. El líquido cefalorraquídeo (LCR) circula en el espacio subaracnoideo entre la aracnoidea y la piamadre, amortiguando el cerebro y también eliminando los desechos a través del sistema glinfático 1,2. En conjunto, esta arquitectura única proporciona un entorno seguro y de apoyo que mantiene la estabilidad del cerebro y lo protege de posibles lesiones.

Durante mucho tiempo se ha considerado que el cerebro es inmunoprivilegiado. Sin embargo, esta noción ha sido parcialmente abandonada ya que la creciente evidencia indica que, además de la microglía residente en el parénquima, los bordes del cerebro, incluyendo el plexo coroideo y las meninges, albergan una amplia gama de células inmunitarias3. Estas células desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis, la vigilancia de la salud del cerebro y el inicio de la respuesta inmunitaria a las lesiones cerebrales. En particular, los hallazgos recientes indican que el cráneo está involucrado en la inmunidad de las meninges y puede contribuir a la respuesta inmune en el cerebro después de una lesión. En 2018, Herisson et al. realizaron un descubrimiento seminal de los canales vasculares directos que unen la médula ósea del cráneo con las meninges, estableciendo así una ruta anatómica para la migración de leucocitos 4,5. Más tarde, Cugurra et al. demostraron que muchas células mieloides (por ejemplo, monocitos y neutrófilos) y células B en las meninges no se originan en la sangre6. Utilizando técnicas como el trasplante de colgajo óseo de calvaria y los regímenes de irradiación selectiva, los autores proporcionaron pruebas convincentes de que la médula ósea del cráneo sirve como fuente local de células mieloides en las meninges, así como del parénquima del SNC después de una lesión del SNC6. Además, otro estudio propuso que las células B meníngeas son suministradas constantemente por la médula ósea del cráneo7. Más recientemente, se ha identificado una nueva estructura, denominada salida del manguito aracnoideo (ECA), como una puerta de entrada directa entre la duramadre y el cerebro para el tráfico de células inmunitarias8.

Estos emocionantes hallazgos tienen implicaciones importantes para el origen de la infiltración de células inmunitarias en el cerebro lesionado (por ejemplo, después de un accidente cerebrovascular isquémico). Una gran cantidad de evidencia ha indicado que después de un accidente cerebrovascular, muchas células inmunitarias se infiltran en el cerebro, contribuyendo tanto al daño cerebral agudo como a la recuperación crónica del cerebro. La noción convencional es que estas células son leucocitos circulantes en la sangre que se infiltran en el cerebro, lo que se ve facilitado en gran medida por el daño de la barrera hematoencefálica inducido por un accidente cerebrovascular. Sin embargo, esta noción ha sido cuestionada. En un estudio, las células inmunitarias en el cráneo y la tibia de los ratones se etiquetaron de manera diferente, y a las 6 horas después del accidente cerebrovascular, se encontró una disminución significativamente mayor de neutrófilos y monocitos en el cráneo en comparación con el cráneo. la tibia y más neutrófilos derivados del cráneo estaban presentes en el cerebro isquémico. Estos datos sugieren que en la fase aguda del accidente cerebrovascular, los neutrófilos en el cerebro isquémico se originan principalmente en la médula ósea del cráneo4. Curiosamente, la peste porcina clásica puede guiar esta migración. De hecho, dos informes recientes demostraron que el LCR puede transmitir directamente señales de señalización desde el cerebro a la médula ósea del cráneo a través de los canales del cráneo, e instruir la migración celular y la hematopoyesis en la médula ósea del cráneo después de una lesión del SNC 9,10.

A la luz de estos hallazgos recientes, se ha vuelto importante analizar los cambios en las células inmunitarias tanto en el cerebro como en la médula ósea del cráneo, al estudiar la respuesta inmunitaria a los trastornos cerebrales. En este tipo de investigaciones, se necesita un número suficiente de células inmunitarias de alta calidad para los análisis posteriores, como la clasificación de células, el análisis de citometría de flujo y la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq). Aquí, el objetivo general es presentar dos procedimientos optimizados para preparar suspensiones unicelulares a partir de tejido cerebral y médula ósea del cráneo. Es importante tener en cuenta que la calvaria (hueso frontal, hueso occipital y huesos parietales) del cráneo se utiliza normalmente para extraer la médula ósea, y esta médula ósea se conoce específicamente como médula ósea del cráneo a lo largo de este estudio.

Protocol

El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Duke (IACUC). En el presente estudio se utilizaron ratones machos C57Bl/6 (3-4 meses de edad; 22-28 g). Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales. 1. Suspensión unicelular del cerebro de ratón NOTA: La Figura 1 ilustra la descripción general del protocolo de aislamiento de…

Representative Results

Para preparar células inmunitarias a partir del tejido cerebral del ratón, el protocolo generalmente produce células con alta viabilidad (84,1% ± 2,3% [media ± DE]). Aproximadamente el 70%-80% de estas células son CD45 positivas. En el cerebro normal del ratón, casi todas las células CD45+ son microglía (CD45LowCD11b+), como se esperaba. Este protocolo se ha utilizado en el laboratorio para diversas aplicaciones, incluido el análisis de citometría de flujo, la clasificación de…

Discussion

Aquí, se presentan dos protocolos simples pero efectivos para aislar las células inmunitarias del cerebro y la médula ósea del cráneo. Estos protocolos pueden producir de forma fiable una gran cantidad de células inmunitarias viables que pueden ser adecuadas para diversas aplicaciones posteriores, en particular para la citometría de flujo.

Para estudiar la neuroinflamación en diversos trastornos cerebrales, se han establecido muchos protocolos para la preparación de células inmunitar…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Kathy Gage por su excelente contribución editorial. Las figuras de ilustración fueron creadas con BioRender.com. Este estudio contó con el apoyo financiero del Departamento de Anestesiología (Centro Médico de la Universidad de Duke) y subvenciones de los NIH NS099590, HL157354 y NS127163.

Materials

0.5 mL microcentrifuge tubes VWR 76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubes VWR 76332-068
15 mL conical tubes Thermo Fisher Scientific 339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle BD Biosciences 305195
1x HBSS Gibco 14175-095
50 mL conical tubes Thermo Fisher Scientific 339653
96-well V-bottom microplate  SARSTEDT 82.1583
AURORA  flow cytometer Cytek bioscience
BSA Fisher BP9706-100
CD11b-AF594 BioLegend 101254 1:500 dilution
CD19-BV785 BioLegend 115543 1:500 dilution
CD19-FITC BioLegend 115506 1:500 dilution
CD3-APC BioLegend 100312 1:500 dilution
CD3-PE BioLegend 100206 1:500 dilution
CD45-Alex 700 BioLegend 103128 1:500 dilution
CD45-BV421 Biolegend 103133 1:500 dilution
Cell Strainer 70 um Avantor 732-2758
Dressing Forceps  V. Mueller NL1410
EDTA Invitrogen 15575-038
Fc Block Biolegend 101320 1:100 dilution
Forceps Roboz RS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific N7167 1:500 dilution
Ly6G-BV421 BioLegend 127628 1:500 dilution
Ly6G-PerCp-cy5.5 BioLegend 127615 1:500 dilution
NK1.1-APC-cy7 BioLegend 108723 1:500 dilution
Percoll (density gradient medium) Cytiva 17089101
Phosphate buffer saline (10x) Gibco 70011-044
RBC Lysis Buffer (10x) BioLegend 420302
Scissors SKLAR 64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size DWK Life Sciences 357544

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Cite This Article
Zhang, R., Zhang, J., Rehman, A. U., Dang, L., Yu, X., Yang, W. Isolating Immune Cells from Mouse Brain and Skull. J. Vis. Exp. (209), e66861, doi:10.3791/66861 (2024).

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