Summary

Isolamento delle cellule immunitarie dal cervello e dal cranio del topo

Published: July 26, 2024
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Summary

Per studiare la risposta immunitaria ai disturbi cerebrali, un approccio comune consiste nell’analizzare i cambiamenti nelle cellule immunitarie. Qui, vengono forniti due protocolli semplici ed efficaci per isolare le cellule immunitarie dal tessuto cerebrale murino e dal midollo osseo del cranio.

Abstract

Prove crescenti indicano che la risposta immunitaria innescata da disturbi cerebrali (ad esempio, ischemia cerebrale ed encefalomielite autoimmune) si verifica non solo nel cervello, ma anche nel cranio. Un passo fondamentale verso l’analisi dei cambiamenti nelle popolazioni di cellule immunitarie sia nel cervello che nel midollo osseo del cranio dopo un danno cerebrale (ad esempio, ictus) è ottenere un numero sufficiente di cellule immunitarie di alta qualità per le analisi a valle. Qui, vengono forniti due protocolli ottimizzati per isolare le cellule immunitarie dal cervello e dal midollo osseo del cranio. I vantaggi di entrambi i protocolli si riflettono nella loro semplicità, velocità ed efficacia nel produrre una grande quantità di cellule immunitarie vitali. Queste cellule possono essere adatte per una vasta gamma di applicazioni a valle, come lo smistamento cellulare, la citometria a flusso e l’analisi trascrittomica. Per dimostrare l’efficacia dei protocolli, sono stati eseguiti esperimenti di immunofenotipizzazione su cervelli colpiti da ictus e midollo osseo cranio cerebrale normale utilizzando l’analisi della citometria a flusso, e i risultati sono stati allineati con i risultati degli studi pubblicati.

Introduction

Il cervello, il fulcro centrale del sistema nervoso, è protetto dal cranio. Sotto il cranio ci sono tre strati di tessuto connettivo noti come meningi: la dura madre, l’aracnoide e la pia madre. Il liquido cerebrospinale (CSF) circola nello spazio subaracnoideo tra l’aracnoide e la pia madre, ammortizzando il cervello e rimuovendo anche i rifiuti attraverso il sistema glinfatico 1,2. Insieme, questa architettura unica fornisce un ambiente sicuro e di supporto che mantiene la stabilità del cervello e lo protegge da potenziali lesioni.

Il cervello è stato a lungo considerato immuno-privilegiato. Tuttavia, questa nozione è stata parzialmente abbandonata poiché prove crescenti indicano che, oltre alle microglia residenti nel parenchima, i bordi del cervello, compreso il plesso coroideo e le meningi, ospitano una vasta gamma di cellule immunitarie3. Queste cellule svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento dell’omeostasi, nella sorveglianza della salute del cervello e nell’avvio della risposta immunitaria alle lesioni cerebrali. In particolare, recenti scoperte indicano che il cranio è coinvolto nell’immunità delle meningi e può contribuire alla risposta immunitaria nel cervello dopo una lesione. Nel 2018, Herisson et al. hanno fatto una scoperta fondamentale dei canali vascolari diretti che collegano il midollo osseo del cranio alle meningi, stabilendo così un percorso anatomico per la migrazione dei leucociti 4,5. Successivamente, Cugurra et al. hanno dimostrato che molte cellule mieloidi (ad esempio, monociti e neutrofili) e le cellule B nelle meningi non originano dal sangue6. Utilizzando tecniche come il trapianto di lembo osseo calvario e regimi di irradiazione selettiva, gli autori hanno fornito prove convincenti che il midollo osseo del cranio funge da fonte locale per le cellule mieloidi nelle meningi e per il parenchima del SNC dopo una lesione del SNC6. Inoltre, un altro studio ha proposto che le cellule B meningee siano costantemente fornite dal midollo osseo del cranio7. Più recentemente, una nuova struttura, chiamata uscita della cuffia aracnoidea (ACE), è stata identificata come una porta diretta tra la dura madre e il cervello per il traffico di cellule immunitarie8.

Questi interessanti risultati hanno importanti implicazioni per l’origine dell’infiltrazione delle cellule immunitarie nel cervello danneggiato (ad esempio, dopo un ictus ischemico). Un ampio corpus di prove ha indicato che dopo l’ictus, molte cellule immunitarie si infiltrano nel cervello, contribuendo sia al danno cerebrale acuto che al recupero cerebrale cronico. L’idea convenzionale è che queste cellule siano leucociti circolanti nel sangue che si infiltrano nel cervello, il che è in gran parte facilitato dal danno alla barriera emato-encefalica indotto dall’ictus. Tuttavia, questa nozione è stata messa in discussione. In uno studio, le cellule immunitarie nel cranio e nella tibia dei topi sono state etichettate in modo diverso e, a 6 ore dall’ictus, è stata riscontrata una diminuzione significativamente maggiore dei neutrofili e dei monociti nel cranio rispetto all’ictus. La tibia e altri neutrofili derivati dal cranio erano presenti nel cervello ischemico. Questi dati suggeriscono che nella fase acuta di ictus, i neutrofili nel cervello ischemico originano principalmente dal midollo osseo del cranio4. È interessante notare che il liquido cerebrospinale può guidare questa migrazione. Infatti, due recenti rapporti hanno dimostrato che il liquido cerebrospinale può trasmettere direttamente segnali di segnalazione dal cervello al midollo osseo del cranio attraverso i canali del cranio e istruire la migrazione cellulare e l’emopoiesi nel midollo osseo del cranio dopo una lesione del SNC 9,10.

Alla luce di queste recenti scoperte, è diventato importante analizzare i cambiamenti nelle cellule immunitarie sia nel cervello che nel midollo osseo del cranio, quando si studia la risposta immunitaria ai disturbi cerebrali. In tali indagini, è necessario un numero sufficiente di cellule immunitarie di alta qualità per le analisi a valle come lo smistamento cellulare, l’analisi della citometria a flusso e il sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNA-seq). Qui, l’obiettivo generale è quello di presentare due procedure ottimizzate per la preparazione di sospensioni unicellulari dal tessuto cerebrale e dal midollo osseo del cranio. È importante notare che la calvaria (osso frontale, osso occipitale e ossa parietali) del cranio viene tipicamente utilizzata per estrarre il midollo osseo e questo midollo osseo è specificamente indicato come midollo osseo del cranio in questo studio.

Protocol

Il protocollo è stato approvato dal Duke Institute Animal Care and Use Committee (IACUC). Nel presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57Bl/6 (3-4 mesi; 22-28 g). I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali. 1. Sospensione di una singola cellula dal cervello di topo NOTA: La Figura 1 illustra la panoramica del protocollo di isolamento delle …

Representative Results

Per preparare le cellule immunitarie dal tessuto cerebrale del topo, il protocollo produce generalmente cellule con un’elevata vitalità (84,1% ± 2,3% [media ± SD]). Circa il 70%-80% di queste cellule sono CD45 positive. Nel cervello di topo normale, quasi tutte le cellule CD45+ sono microglia (CD45LowCD11b+), come previsto. Questo protocollo è stato utilizzato in laboratorio per varie applicazioni, tra cui l’analisi della citometria a flusso, la selezione cellulare attivata dalla fluo…

Discussion

Qui, vengono presentati due protocolli semplici ma efficaci per isolare le cellule immunitarie dal cervello e dal midollo osseo del cranio. Questi protocolli possono produrre in modo affidabile una grande quantità di cellule immunitarie vitali che possono essere adatte per diverse applicazioni a valle, in particolare per la citometria a flusso.

Per studiare la neuroinfiammazione in vari disturbi cerebrali, sono stati stabiliti molti protocolli per i preparati di cellule immunitarie dal cervel…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Kathy Gage per il suo eccellente contributo editoriale. Le figure illustrative sono state create con BioRender.com. Questo studio è stato supportato da fondi del Dipartimento di Anestesiologia (Duke University Medical Center) e da sovvenzioni NIH NS099590, HL157354 e NS127163.

Materials

0.5 mL microcentrifuge tubes VWR 76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubes VWR 76332-068
15 mL conical tubes Thermo Fisher Scientific 339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle BD Biosciences 305195
1x HBSS Gibco 14175-095
50 mL conical tubes Thermo Fisher Scientific 339653
96-well V-bottom microplate  SARSTEDT 82.1583
AURORA  flow cytometer Cytek bioscience
BSA Fisher BP9706-100
CD11b-AF594 BioLegend 101254 1:500 dilution
CD19-BV785 BioLegend 115543 1:500 dilution
CD19-FITC BioLegend 115506 1:500 dilution
CD3-APC BioLegend 100312 1:500 dilution
CD3-PE BioLegend 100206 1:500 dilution
CD45-Alex 700 BioLegend 103128 1:500 dilution
CD45-BV421 Biolegend 103133 1:500 dilution
Cell Strainer 70 um Avantor 732-2758
Dressing Forceps  V. Mueller NL1410
EDTA Invitrogen 15575-038
Fc Block Biolegend 101320 1:100 dilution
Forceps Roboz RS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific N7167 1:500 dilution
Ly6G-BV421 BioLegend 127628 1:500 dilution
Ly6G-PerCp-cy5.5 BioLegend 127615 1:500 dilution
NK1.1-APC-cy7 BioLegend 108723 1:500 dilution
Percoll (density gradient medium) Cytiva 17089101
Phosphate buffer saline (10x) Gibco 70011-044
RBC Lysis Buffer (10x) BioLegend 420302
Scissors SKLAR 64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size DWK Life Sciences 357544

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Cite This Article
Zhang, R., Zhang, J., Rehman, A. U., Dang, L., Yu, X., Yang, W. Isolating Immune Cells from Mouse Brain and Skull. J. Vis. Exp. (209), e66861, doi:10.3791/66861 (2024).

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