Митохондриальная трансформация у Бейкера

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются широко признанной моделью, используемой для изучения митохондриального биогенеза. Поскольку дрожжи являются анаэробным, факультативным организмом, можно широко изучить причины и последствия внесения мутаций, ухудшающих дыхание. Кроме того, этот организм обладает дружественными генетическими и биохимическими инструментами для изучения митохондриальных путей. Тем не менее, одним из самых мощных ресурсов для изучения механизмов сборки дыхательных комплексов и синтеза митохондриальных белков является способность трансформировать митохондрии и модифицировать геном органеллы. Ранее было полезно вводить в митохондриальную ДНК (мтДНК) точечные мутации или небольшие делеции/вставки ^1,2,3,4,5, удалять гены ^6,7, производить перестройку генов ^7,8, добавлять эпитопы к митохондриальным белкам ^9,10, перемещать гены из ядра в митохондрии^11,12, и ввести репортерные гены, такие как BarStar¹³, GFP^14,15, люциферазу¹⁶ и наиболее широко используемый ARG8^m17,18. Модификации митохондриального генома позволили нам проанализировать и идентифицировать механизмы, которые в противном случае было бы трудно понять. Например, репортерный ген ARG8^m, вставленный в локус ЦОГ1 в митохондриальной ДНК, имел решающее значение для понимания того, что Mss51 играет двойную роль в биогенезе ЦОГ1. Во-первых, это трансляционный активатор мРНК ЦОГ1, а во-вторых, это сборочный шаперон для недавно созданного белка ЦОГ1 ^7,19. В данной работе представлен подробный метод трансформации митохондрий S. cerevisiae. Несмотря на то, что протокол митохондриальной трансформации был опубликован ранее 16,20,21,22,23, визуальный подход с помощью видео необходим для полного понимания различных этапов и деталей метода. Метод состоит из различных этапов и делится на четыре основных этапа:

Рисунок 1: Обзор процедуры трансформации митохондрий с помощью высокоскоростной бомбардировки микроснарядами: 1) Частицы вольфрама стерилизуются и подготавливаются перед нанесением покрытия ДНК. 2) Две разные плазмиды выпадают в осадок на поверхности БФ. Одним из них является бактериальная плазмида, содержащая конструкцию, которая будет направлена к митохондриальному матриксу. Другой представляет собой вектор экспрессии ядерных дрожжей, несущий маркер ауксотрофии. 3) Рецепторный штамм дрожжей, лишенный митохондриальной ДНК (rho⁰), выращивается на ферментативном источнике углерода, таком как галактоза или рафиноза, который не оказывает никакого подавления глюкозы в экспрессии митохондриальных генов^34,35. Культуру выкладывают на чашки Петри, содержащие бомбардирующую среду. 4) БФ, покрытые плазмидами, выстреливаются в штамм рецептора путем высокоскоростной бомбардировки микроснарядами. 5) Положительные синтетические колонии ро^–, содержащие митохондриальную плазмиду, отбираются путем скрещивания с тестером-штаммом. 6) Митохондриальная конструкция интегрируется в митохондриальный геном в нужном локусе путем скрещивания ^{синтетического штамма} (донора) с акцепторным штаммом с помощью процесса, известного как цитодукция. 7) Положительный рецептор, гаплоидный штамм, несущий митохондриальную конструкцию, отбирается и очищается в различных средах. Сокращения: WPs = частицы вольфрама; мтДНК = митохондриальная ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Трансформация клеток с помощью ДНК-конструкции, предназначенной для интеграции в митохондриальный геном (рис. 1, шаги 1-4)
Несмотря на то, что дрожжи, содержащие полный митохондриальный геном (rho⁺), можно напрямую трансформировать, если в клетках отсутствует митохондриальная ДНК (rho⁰)²⁴. Частицы вольфрама (ВП) покрыты двумя различными плазмидами, которые будут совместно трансформироваться. Первый из них представляет собой вектор экспрессии дрожжей 2 μ, несущий маркер ауксотрофии, такой как LEU2 или URA3 (например, YEp351 или YEp352 соответственно). Если биолистическое внедрение ДНК в дрожжевые клетки проходит успешно, трансформанты будут расти на ауксотрофной среде (т.е. в среде, лишенной лейцина или урацила). Эта плазмида полезна при первом отборе клеток, которые приобрели ядерную плазмиду; В противном случае количество образовавшихся колоний насытило бы пластину. Вторая плазмида представляет собой бактериальную плазмиду (например, pBluescript или аналогичную), содержащую митохондриальную конструкцию, предназначенную для интеграции в митохондриальный геном. Конструкция должна содержать, по меньшей мере, 100 nt 5′ и 3′ фланкирующих митохондриальных последовательностей для рекомбинации с митохондриальной областью, представляющей интерес. По нашему опыту, более крупные фланкирующие последовательности с большей вероятностью успешно рекомбинируются с локусом-мишенью в митохондриальном геноме.

Конкретный пример показан на рисунке 2²⁵. В этом примере цель состояла в том, чтобы удалить область митохондриального гена COX1 , кодирующую последние 15 аминокислот соответствующего белка (Cox1ΔC15) (рис. 2A). Бактериальная плазмида, несущая мутацию COX1ΔC15 , содержала 395 nt и 990 nt 5′ и 3′ нетранслируемых областей гена соответственно. Плазмида была получена из pBluescript (pXPM61) и вместе с 2 μ плазмидой YEp352 была соципирована на поверхности WP (рис. 2B). Затем РГ вводили путем бомбардировки микроснарядами в выбранный штамм-реципиент (рис. 2C). Этот штамм, получивший название NAB69²⁶, представляет собой штамм MATa, rho⁰ , несущий аллели kar1-1 и ade2 (важность этих характеристик обсуждается ниже). Клетки наносили на бомбардирующие среды, в которых отсутствовал урацил, чтобы выбрать те, которые приобрели 2 μ плазмиды (рис. 2C). Клетки выращивали в течение 5-7 ночей при 30 °С.

Отбор клеток, которые приобрели бактериальную плазмиду, содержащую митохондриальную конструкцию, и ядерную плазмиду 2 μ, несущую маркер ауксотрофии (рис. 1, шаг 5)
Положительные колонии сохраняют много копий бактериальной плазмиды в своих митохондриях²². Поскольку трансформированные клетки изначально являются rho⁰, никакие митохондриальные последовательности не поддерживают трансляцию митохондриальной конструкции, присутствующей в плазмиде; Следовательно, трансформированный митохондриальный ген не будет экспрессироваться. Необходимо сопрягать трансформанты со штаммом тестера, чтобы обнаружить колонии дрожжей, которые приобрели митохондриальную плазмиду. Митохондриальный геном тестерного штамма содержит нефункциональную мутировавшую версию интересующего гена. После спаривания митохондрии сливаются, и митохондриальная последовательность, включенная в трансформированную плазмиду, рекомбинируется с мутировавшим митохондриальным геном из тестерового штамма; следовательно, восстановление гена WT восстановит функцию. Полученный диплоид будет иметь обнаруживаемый положительный фенотип (обычно способность к росту в дыхательной среде или в среде, в которой отсутствует аргинин). Положительные клетки, несущие бактериальную плазмиду в митохондриях, называются «синтетическими ро-клетками». В конкретном примере на рисунке 2D синтетические ^{ро-клетки}, несущие конструкцию COX1ΔC15 (названную XPM199), были реплицированы на среде, в которой отсутствует урацил (это основная пластина, из которой были очищены положительные колонии). Они также были реплицированы на тестовом штамме L45²⁷ Газон, который содержит нефункциональную мутацию cox1D369N. После спаривания в течение двух ночей митохондриальный геном L45 и XPM199 рекомбинировался, в результате чего образовался функциональный ген COX1; Таким образом, диплоиды восстановили способность к росту на дыхательных средах. С эталонной пластины мы отобрали положительные колонии. Они были нанесены на пластины, в которых отсутствовал урацил, и селективные тесты были повторены для получения чистых синтетических ^{ро-клеток} (рис. 2E). Важно отметить, что тестовая пластина предназначена только для идентификации синтетических ^{колоний}, и мутанты не могут быть извлечены из этих пластин.

Интеграция конструкта в митохондриальный геном предполагаемого штамма
Этот этап достигается с помощью процесса, называемого цитодукцией^28,29 (рис. 1, стадия 6). При таком подходе синтетический штамм rho^– (донорский штамм) сопрягают с предполагаемым акцепторным штаммом противоположного типа сопряжения. Существенным требованием является то, что по крайней мере один из двух брачных штаммов несет мутацию kar1-1, препятствующую ядерному синтезу³⁰. Следовательно, в результате скрещивания двух клеток образуется двуядерная зигота (рис. 3). Митохондриальная сеть родительских клеток (донорской и акцепторной) сливается, и молекулы митохондриальной ДНК рекомбинируют. Двуядерные зиготы инкубируются/восстанавливаются, чтобы обеспечить почкование, которое приведет к образованию гаплоидных клеток. Эти гаплоиды несут ядерный фон одной из родительских клеток. Точно так же гаплоиды могут переносить митохондриальную ДНК либо из родительской клетки, либо из рекомбинированной митохондриальной ДНК, представляющей интерес. Тем не менее, мутация kar1-1 не эффективна на 100%, и некоторые истинные диплоиды будут образовываться во время спаривания ^28,29. Синтетический штамм rho^– (донор, XPM199) нес аллель kar1-1 в этом примере. В качестве селективного маркера он обладал аллелем ade2, что делало его ауксотрофом для аденина (рис. 4). Акцепторным штаммом был XPM10, штамм rho⁺, несущий конструкцию cox1Δ::ARG8^m, где репортерный ARG8^m заменил кодоны COX1 в митохондриальном геноме⁷. Смесь обеих клеточных культур добавляли в планшет YPD в качестве капли для обеспечения спаривания. Через 3-5 ч клетки наблюдали под световым микроскопом, чтобы обнаружить образование shmoos (рис. 3B), клеточной формы, связанной со спариванием. По истечении периода инкубации/восстановления биядерные зиготы помещали на среду, в которой отсутствовал аденин, чтобы предотвратить рост донорских клеток.

Выбор гаплоидного штамма, несущего интересующий митохондриальный геном (рис. 1, шаг 7)
После цитодукции присутствует смесь донорных, акцепторных и диплоидных клеток. Таким образом, после инкубации/восстановления двуядерных зигот клетки должны быть выращены в различных селективных средах для идентификации и очистки интересующих гаплоидов. Селективная среда зависит от генотипов донора, акцепторных штаммов и предполагаемой митохондриальной конструкции. Однако, в целом, обоснование выбора селективных сред заключается в следующем: i) после инкубации/восстановления цитодукционная смесь выращивается на селективной среде, где родительский штамм-донор не может расти. В конкретном примере на рисунках 4А, В донор (синтетический штамм ^{ро-штамма} ) несет нефункциональный аллель ade2 . Таким образом, цитодукционную смесь необходимо инкубировать на средней тарелке, лишенной аденина. Это мастер-плита. ii) По мере того, как колонии вырастают, эталонная пластина снова реплицируется на среде, лишенной аденина (для создания новой эталонной пластины, из которой будут очищаться положительные колонии, представляющие интерес), а затем на среде, где могут расти только диплоиды. Это необходимо для того, чтобы избежать дальнейшей непреднамеренной очистки диплоидных колоний. В примере с рисунка 4C только диплоиды могут расти на средах, лишенных лейцина. iii) Мастер-пластина также реплицируется на средах, где будут расти только те акцепторные гаплоиды, которые включают в себя интересующую митохондриальную ДНК. В примере на рисунке 4C гаплоиды растут на дыхательных средах, содержащих этанол/глицерин в качестве источника углерода, поскольку белокCox1 Δ C15является функциональным. Полученный штамм rho⁺ , несущий представляющую интерес мтДНК, был назван XPM209²⁵. Деформации, используемые на рисунках 2 и 4 , перечислены в таблице 1.

Рисунок 2: Диаграмма, описывающая конкретный пример митохондриальной трансформации и отбора положительных ^{ро-клеток}. (А) Предполагаемой модификацией митохондриального генома была делеция участка, кодирующего последние 15 аминокислот субъединицы Cox1 (Cox1ΔC15). (В) БФ были покрыты двумя плазмидами для трансформации дрожжевых клеток. Одним из них была 2 μ плазмида Yep352, которая была направлена и экспрессировалась в ядре. Другой была плазмида pXPM61, которая содержит аллель COX1ΔC15 плюс 395 nt и 990 nt 5′ и 3′-UTRs COX1 соответственно. (C) БФ были введены в клетки из штамма NAB69, в котором отсутствует митохондриальная ДНК (штамм rho⁰). Колонии трансформантов, полученные из бомбардировочных пластин, реплицировались на среде, в которой отсутствует урацил, ауксотрофный маркер ядерной плазмиды YEp352. (D) Для отбора ^{положительных} ро-колоний пластину -URA реплицировали на среде, в которой отсутствует урацил. Это была эталонная пластина, с которой отбирались и изолировались положительные колонии. Он также был воспроизведен на пластинах с богатой средой (YPD) и газоне из тестера штамма. Во время скрещивания синтетическая ро-митохондриальная ДНК была рекомбинирована с митохондриальной ДНК из тестерного штамма L45²⁷, который несет мутацию в гене COX1 (D369N). Диплоиды, выросшие на дыхательных средах, содержали трансформированную ДНК. Соответствующие колонии были отобраны с эталонной пластины для восстановления и очистки. Чтобы помочь идентифицировать положительные колонии на эталонной пластине на протяжении всей копии покрытия, по краям пластин были сделаны метки постоянным маркером (зеленые линии). (E) Отобранные положительные колонии были восстановлены на среде, в которой отсутствовал урацил. Это была новая эталонная пластина. Как и в случае с D, было проведено еще два раунда испытаний для очистки синтетических ^{колоний}. Сокращения: WPs = частицы вольфрама; мтДНК = митохондриальная ДНК; -URA/Sorb = отсутствует урацил/, содержащий сорбит; WT = дикий тип. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Схема, описывающая процедуру цитодукции. (А) Общий обзор того, как клетки спариваются во время цитодукции. Во время цитодукции митохондрии донорского и акцепторного штаммов сливаются, поэтому митохондриальная ДНК обоих штаммов рекомбинирует. Поскольку ядерный синтез снижается из-за мутации kar1-1 ³⁰, образуются биядерные зиготы. После некоторого времени инкубации/восстановления отбираются зачатки бинуклеарных зигот и гаплоидные акцепторы, содержащие предполагаемую митохондриальную мутацию. (Б) Спаривание синтетического штамма rho^– (донора) и акцепторного штамма посредством цитодукции позволяет образовывать шмоос (красные стрелки), характерную форму спаривающихся дрожжей. Изображение было получено под световым микроскопом со 100-кратным объективом. Масштабная линейка = 10 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Диаграмма, описывающая конкретный пример цитодукции для интеграции мутации COX1ΔC15 в митохондриальный геном. (A) Жидкие культуры синтетического штамма rho^– (донор, XPM199) и представляющего интерес штамма (акцептор, XPM10) были смешаны для спаривания. После образования шму смесь восстанавливали в жидкой культуре в течение 2-4 ч. Затем цитодукционную смесь наносили на планшет со средой, в которой отсутствовал аденин для предотвращения роста донорских клеток. (B) Схематическое изображение событий рекомбинации митохондриальной ДНК от донора (XPM199) и акцептора (XPM10) во время цитодкции. (C) Мастер-пластину реплицировали на различных селективных средах для идентификации и очистки тех гаплоидов, которые интегрировали предполагаемый митохондриальный ген в ДНК органеллы (XPM209)²⁵. Сокращения: -ADE = отсутствует аденин; -LEU = недостаток лейцина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.