Baker'da Mitokondriyal Dönüşüm

Saccharomyces cerevisiae mayası, mitokondriyal biyogenezi incelemek için kullanılan, yaygın olarak tanınan bir modeldir. Maya anaerobik, fakültatif bir organizma olduğundan, solunumu bozan mutasyonların ortaya çıkmasının nedenlerini ve sonuçlarını kapsamlı bir şekilde incelemek mümkündür. Ek olarak, bu organizma mitokondriyal yolları incelemek için dost genetik ve biyokimyasal araçlara sahiptir. Bununla birlikte, solunum kompleksi montajı ve mitokondriyal protein sentezi mekanizmalarını keşfetmek için en güçlü kaynaklardan biri, mitokondriyi dönüştürme ve organelin genomunu değiştirme yeteneğidir. Daha önce, mitokondriyal DNA (mtDNA) nokta mutasyonları veya küçük delesyonlar/eklemeler ^1,2,3,4,5, genleri silmek ^6,7, gen yeniden düzenlemeleri yapmak ^7,8, mitokondriyal proteinlere^epitoplar eklemek ^9,10, genleri çekirdekten mitokondriye^{taşımak 11,12} ve BarStar¹³, GFP^14,15, lusiferaz¹⁶ ve en yaygın kullanılan ARG8^m17,18 gibi muhabir genlerini tanıtın. Mitokondriyal genom modifikasyonları, aksi takdirde anlaşılması zor olan mekanizmaları incelememize ve tanımlamamıza izin verdi. Örneğin, mitokondriyal DNA’daki COX1 lokusuna yerleştirilen ARG8^m raportör geni, Mss51’in Cox1 biyogenezinde ikili bir role sahip olduğunu anlamak için çok önemliydi. Birincisi, COX1 mRNA’nın translasyonel bir aktivatörüdür ve ikincisi, yeni yapılan Cox1 proteini ^7,19 için bir montaj şaperonudur. Bu çalışma, S. cerevisiae mitokondrisini dönüştürmek için ayrıntılı bir yöntem sunmaktadır. Mitokondriyal dönüşüm protokolü daha önce yayınlanmış olsa da 16,20,21,22,23, yöntemin farklı aşamalarını ve ayrıntılarını tam olarak anlamak için bir video aracılığıyla görsel bir yaklaşım şarttır. Yöntem çeşitli adımlardan oluşur ve dört genel aşamaya ayrılır:

Şekil 1: Yüksek hızlı mikromermi bombardımanı ile mitokondriyal dönüşüm prosedürüne genel bakış: 1) Tungsten parçacıkları sterilize edilir ve DNA kaplamasından önce hazırlanır. 2) WP’lerin yüzeyinde iki farklı plazmit çökeltilir. Biri, mitokondriyal matrise yönlendirilecek yapıyı içeren bir bakteri plazmitidir. Diğeri, bir oksotrofi markörü taşıyan bir nükleer maya ekspresyon vektörüdür. 3) Mitokondriyal DNA’dan (rho⁰) yoksun bir reseptör maya suşu, mitokondriyal gen ekspresyonunun^34,35 herhangi bir glikoz baskılamasını uygulamayan galaktoz veya rafinoz gibi fermentatif bir karbon kaynağı üzerinde büyütülür. Kültür, bombardıman ortamını içeren petri kaplarına yayılır. 4) Plazmitlerle kaplanmış WP’ler, yüksek hızlı mikromermi bombardımanı ile reseptör suşuna vurulur. 5) Mitokondriyal plazmid içeren pozitif sentetik ^rhokoloniler, bir test edici suşla eşleştirilerek seçilir. 6) Mitokondriyal yapı, sentetik rho-suşun (donör) alıcı suş ile sitodüksiyon olarak bilinen bir işlemle çiftleştirilmesiyle istenen lokusta mitokondriyal genoma entegre edilir. 7) Mitokondriyal yapıyı taşıyan pozitif reseptör, haploid suş seçilir ve farklı ortamlarda saflaştırılır. Kısaltmalar: WP’ler = tungsten parçacıkları; mtDNA = mitokondriyal DNA. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Mitokondriyal genoma entegre olması amaçlanan DNA yapısı ile hücrelerin dönüşümü (Şekil 1, adım 1-4)
Tam bir mitokondriyal genom (rho⁺) içeren bir mayayı doğrudan dönüştürmek mümkün olsa da, hücrelerde mitokondriyal DNA (rho⁰) yoksa dönüşüm 10-20 kat daha ^{verimlidir.24}. Tungsten parçacıkları (WP’ler), birlikte dönüştürülecek iki farklı plazmit ile kaplanır. Birincisi, LEU2 veya URA3 gibi bir oksotrofi belirteci taşıyan bir maya 2 μ ekspresyon vektörüdür (örneğin, sırasıyla YEp351 veya YEp352). DNA’nın maya hücrelerine biyolistik girişi başarılı olursa, dönüştürücüler oksotrofi ortamında (yani, lösin veya urasil içermeyen bir ortam) büyüyecektir. Bu plazmit, nükleer plazmidi edinen hücrelerin ilk seçiminin yapılmasında yardımcı olur; Aksi takdirde, ortaya çıkan kolonilerin sayısı plakayı doyurur. İkinci plazmit, mitokondriyal genoma entegre edilmesi amaçlanan mitokondriyal yapıyı içeren bir bakteri plazmitidir (pBluescript veya benzeri gibi). Yapı, ilgilenilen mitokondriyal bölge ile rekombinasyon için en az 100 nt 5′ ve 3′ yan mitokondriyal dizi içermelidir. Deneyimlerimize göre, daha büyük yan dizilerin mitokondriyal genomdaki hedef lokus ile başarılı bir şekilde yeniden birleşme olasılığı daha yüksektir.

Spesifik bir örnek Şekil 2^25’te gösterilmiştir. Bu örnekte amaç, karşılık gelen proteinin (Cox1ΔC15) son 15 amino asidini kodlayan mitokondriyal COX1 geninin bölgesini silmekti (Şekil 2A). COX1ΔC15 mutasyonunu taşıyan bakteri plazmidi, genin 5′ ve 3′ çevrilmemiş bölgelerinin sırasıyla 395 nt ve 990 nt’sini içeriyordu. Plazmit, pBluescript’ten (pXPM61) türetildi ve 2 μ plazmid YEp352 ile birlikte WP’lerin yüzeyinde birlikte çökeltildi (Şekil 2B). WP’ler daha sonra mikromermi bombardımanı ile seçilen alıcı suşuna sokuldu (Şekil 2C). NAB69²⁶ olarak adlandırılan bu suş, kar1-1 ve ade2 alellerini taşıyan bir MATa, rho⁰ suşudur (bu özelliklerin önemi aşağıda tartışılmıştır). Hücreler, 2 μ plazmidi edinenleri seçmek için urasil içermeyen bombardıman ortamı üzerine kaplandı (Şekil 2C). Hücreler 30 ° C’de 5-7 gece büyütüldü.

Mitokondriyal yapıyı içeren bakteri plazmidini ve oksotrofi markörünü taşıyan nükleer 2 μ plazmiti edinen hücrelerin seçimi (Şekil 1, adım 5)
Pozitif koloniler, mitokondrilerinde bakteri plazmidinin birçok kopyasını tutacaktır²². Dönüştürülmüş hücreler orijinal olarak rho⁰ olduğundan, plazmidde bulunan mitokondriyal yapının translasyonunu destekleyen hiçbir mitokondriyal dizi; bu nedenle, dönüştürülmüş mitokondriyal gen ifade edilmeyecektir. Mitokondriyal plazmidi elde eden maya kolonilerini tespit etmek için transformatörleri bir test suşu ile eşleştirmek gerekir. Test edici suşun mitokondriyal genomu, ilgilenilen genin işlevsel olmayan mutasyona uğramış bir versiyonunu içerir. Çiftleşmeden sonra, mitokondri birleşecek ve dönüştürülmüş plazmide dahil edilen mitokondriyal dizi, test edici suştan mutasyona uğramış mitokondriyal gen ile yeniden birleşecektir; sonuç olarak, WT geninin geri kazanılması, işlevi yeniden oluşturacaktır. Ortaya çıkan diploid, saptanabilir bir pozitif fenotipe sahip olacaktır (genellikle solunum ortamında veya arginin içermeyen bir ortamda büyüme kapasitesi). Mitokondride bakteri plazmidini taşıyan pozitif hücrelere “sentetik rho^– hücreleri” adı verilir. Şekil 2D’nin spesifik örneğinde, COX1ΔC15 yapısını (XPM199 olarak adlandırılır) taşıyan sentetik rho^– hücreleri, urasil içermeyen bir ortam üzerinde replika kaplanmıştır (bu, pozitif kolonilerin saflaştırıldığı ana plakadır). Ayrıca, işlevsel olmayan mutasyon cox1D369N içeren bir test cihazı suşu L45²⁷ çimi üzerinde replika kaplandılar. İki gece çiftleştikten sonra, L45 ve XPM199’un mitokondriyal genomu yeniden birleşti ve fonksiyonel bir COX1 geni ile sonuçlandı; Bu nedenle, diploidler solunum ortamında büyüme yeteneğini geri kazandı. Ana plakadan pozitif kolonileri seçtik. Urasil içermeyen plakalar üzerine çizildiler ve saf sentetik ^{rho-hücreleri} elde etmek için seçici testler tekrarlandılar (Şekil 2E). Test plakasının sadece sentetik ^{rhokolonilerin} tanımlanması için olduğunu ve mutantların bu plakalardan geri kazanılamayacağını belirtmek önemlidir.

Yapının, amaçlanan suşun mitokondriyal genomuna entegrasyonu
Bu adım, sitodüksiyon^28,29 adı verilen bir işlemle gerçekleştirilir (Şekil 1, adım 6). Bu yaklaşımda, sentetik rho^{– suşu} (donör suşu), zıt eşleşme tipinin amaçlanan alıcı suşu ile eşleştirilir. Temel bir gereklilik, iki çiftleşme suşundan en az birinin nükleer füzyonu³⁰ engellemek için kar1-1 mutasyonunu taşımasıdır. Bu nedenle, iki hücrenin çiftleşmesi iki çekirdekli bir zigot üretir (Şekil 3). Ebeveyn hücrelerden (verici ve alıcı) gelen mitokondriyal ağ birleşir ve mitokondriyal DNA molekülleri yeniden birleşir. İki çekirdekli zigotlar, haploid hücreler üretecek olan tomurcuklanmaya izin vermek için inkübe edilir/geri kazanılır. Bu haploidler, ebeveyn hücrelerinden birinin nükleer arka planını taşır. Benzer şekilde, haploidler mitokondriyal DNA’yı ebeveyn hücresinden veya ilgilenilen rekombine mitokondriyal DNA’dan taşıyabilir. Bununla birlikte, kar1-1 mutasyonu% 100 etkili değildir ve çiftleşme sırasında bazı gerçek diploidler oluşacaktır^28,29. Sentetik rho^{– suşu} (donör, XPM199) örnekteki kar1-1 alelini taşıdı. Seçici bir belirteç olarak, ade2 aleline sahipti ve bu da onu adenin için bir oksotrof haline getirdi (Şekil 4). Alıcı suş, raportör ARG8^m’nin mitokondriyal genom 7’deki COX1 kodonlarının yerini aldığı cox1Δ::ARG8^m yapısını taşıyan bir rho⁺ suşu olan^XPM10 idi. Her iki hücre kültürünün karışımı, çiftleşmeye izin vermek için bir damla olarak bir YPD plakasına eklendi. 3-5 saat sonra, hücreler, çiftleşme ile ilişkili bir hücre şekli olan shmoos oluşumunu tespit etmek için bir ışık mikroskobu altında gözlemlendi (Şekil 3B). Kuluçka / geri kazanım süresinden sonra, binükleer zigotlar, donör hücrelerin büyümesini önlemek için adenin içermeyen bir ortam üzerine kaplandı.

İlgilenilen mitokondriyal genomu taşıyan haploid suşun seçimi (Şekil 1, adım 7)
Sitodeksiyondan sonra donör, alıcı ve diploid hücrelerin bir karışımı mevcuttur. Bu nedenle, iki çekirdekli zigotların inkübasyonundan/geri kazanımından sonra, ilgilenilen haploidleri tanımlamak ve saflaştırmak için hücrelerin farklı seçici ortamlarda büyütülmesi gerekir. Seçici ortam, vericinin genotiplerine, alıcı suşlara ve amaçlanan mitokondriyal yapıya bağlıdır. Bununla birlikte, genel olarak, seçici ortamın seçilmesinin mantığı şudur: i) inkübasyon / geri kazanımdan sonra, sitüldüksiyon karışımı, donör ebeveyn suşunun büyüyemediği seçici ortamda büyütülür. Şekil 4A,B’deki spesifik örnekte, donör (sentetik ^rho-suş) fonksiyonel olmayan ade2 alelini taşır. Bu nedenle, sitodüksiyon karışımı, adenin içermeyen orta boy bir plaka üzerinde inkübe edilmelidir. Bu ana plakadır. ii) Koloniler büyüdükten sonra, ana plaka, adenin içermeyen bir ortamda (ilgilenilen pozitif kolonilerin saflaştırılacağı yeni bir ana plaka oluşturmak için) ve daha sonra sadece diploidlerin büyüyebileceği bir ortamda tekrar kopyalanır. Bu, diploid kolonilerin yanlışlıkla daha fazla saflaştırılmasını önlemek için gereklidir. Şekil 4C’deki örnekte olduğu gibi, lösin içermeyen ortamlarda sadece diploidler büyüyebilir. iii) Ana plaka, yalnızca ilgilenilen mitokondriyal DNA’yı içeren alıcı haploidlerin büyüyeceği ortamda da çoğaltılır. Şekil 4C örneğinde, Cox1ΔC15 proteini işlevsel olduğundan, haploidler karbon kaynağı olarak etanol/gliserol içeren solunum ortamlarında büyür. İlgilenilen mtDNA’yı taşıyan ortaya çıkan rho⁺ suşu XPM209²⁵ olarak adlandırıldı. Şekil 2 ve Şekil 4’te kullanılan suşlar Tablo 1’de listelenmiştir.

Şekil 2: Mitokondriyal dönüşümün belirli bir örneğini ve pozitif rho hücrelerinin seçimini açıklayan diyagram. (A) Mitokondriyal genomun amaçlanan modifikasyonu, Cox1 alt biriminin (Cox1ΔC15) son 15 amino asidini kodlayan bölgenin silinmesiydi. (B) WP’ler, maya hücrelerini dönüştürmek için iki plazmit ile kaplandı. Biri, çekirdekte yönlendirilen ve eksprese edilen 2 μ plazmid Yep352 idi. Diğeri, COX1ΔC15 alelini artı COX1 5′ ve 3′-UTR’lerin sırasıyla 395 nt ve 990 nt’sini içeren plazmid pXPM61 idi. (C) WP’ler, mitokondriyal DNA’dan (rho⁰ suşu) yoksun olan NAB69 suşundan hücrelere sokuldu. Bombardıman plakalarından elde edilen transformant koloniler, nükleer plazmid YEp352’nin oksotrofik belirteci olan urasil içermeyen bir ortam üzerinde çoğaltıldı. (D) Pozitif ^{rhokolonileri} seçmek için, -URA plakası urasil içermeyen bir ortam üzerinde çoğaltıldı. Bu, pozitif kolonilerin toplandığı ve izole edildiği ana plakaydı. Ayrıca zengin ortam (YPD) ve bir test cihazı suşunun çimi olan plakalar üzerinde de çoğaltıldı. Çiftleşme sırasında, sentetik rho-mitokondriyal DNA, COX1 geninde (D369N) bir mutasyon taşıyan test edici suş L45^27’den mitokondriyal DNA ile yeniden birleştirildi. Solunum ortamında büyüyen diploidler, dönüştürülmüş DNA’yı içeriyordu. Karşılık gelen koloniler, yeniden doldurmak ve saflaştırmak için ana plakadan toplandı. Tüm replika kaplama boyunca ana plakadaki pozitif kolonileri tanımlamaya yardımcı olmak için, plakaların kenarlarında kalıcı bir işaretleyici ile işaretler yapıldı (yeşil çizgiler). (E) Seçilen pozitif koloniler, urasil içermeyen bir ortam üzerinde yeniden yerleştirildi. Bu yeni ana plakaydı. D’de olduğu gibi, sentetik ^{rhokolonileri} saflaştırmak için iki tur daha test yapıldı. Kısaltmalar: WP’ler = tungsten parçacıkları; mtDNA = mitokondriyal DNA; -URA/Sorb = urasil eksikliği/ Sorbitol içeren; WT = vahşi tür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Sitülasyon prosedürünü açıklayan diyagram. (A) Sitülasyon sırasında hücrelerin nasıl çiftleştiğine genel bakış. Sitoddüksiyon sırasında, donör ve alıcı suşlardan gelen mitokondri birleşir, böylece her iki suştan gelen mitokondriyal DNA yeniden birleşir. Kar1-1 mutasyonu³⁰ nedeniyle nükleer füzyon azaldığından, binükleer zigotlar oluşur. Bir miktar inkübasyon/iyileşme süresinden sonra, amaçlanan mitokondriyal mutasyonu içeren binükleer zigot tomurcuğu ve haploid alıcıları seçilir. (B) Sentetik ^rho-suş (donör) ve alıcı suşun sitodüksiyon yoluyla çiftleşmesi, çiftleşme mayasının karakteristik bir şekli olan shmoos (kırmızı oklar) oluşumuna izin verir. Görüntü, 100x objektif ile ışık mikroskobu altında çekildi. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: COX1ΔC15 mutasyonunu mitokondriyal genoma entegre etmek için spesifik bir sitodüksiyon örneğini açıklayan diyagram. (A) Sentetik rho^– suşun (donör, XPM199) ve ilgilenilen suşun (alıcı, XPM10) sıvı kültürleri çiftleşmek için karıştırıldı. Shmoo oluşumundan sonra, karışım 2-4 saat boyunca sıvı bir kültürde geri kazanıldı. Daha sonra, sitodüksiyon karışımı, donör hücrelerin büyümesini önlemek için orta derecede adenin içermeyen bir plaka üzerine yayıldı. (B) Sitodüksiyon sırasında donörden (XPM199) ve alıcıdan (XPM10) mitokondriyal DNA’nın rekombinasyon olaylarının şematik gösterimi. (C) Ana plaka, amaçlanan mitokondriyal geni organelin DNA’sına entegre eden haploidleri tanımlamak ve saflaştırmak için farklı seçici ortamlarda çoğaltıldı (XPM209)²⁵. Kısaltmalar: -ADE = adenin eksikliği; -LEU = lösin eksikliği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.