Mitochondriale Transformation bei Baker

Die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist ein weithin anerkanntes Modell zur Untersuchung der mitochondrialen Biogenese. Da es sich bei der Hefe um einen anaeroben, fakultativen Organismus handelt, ist es möglich, die Ursachen und Folgen der Einführung von Mutationen, die die Atmung beeinträchtigen, umfassend zu untersuchen. Darüber hinaus verfügt dieser Organismus über freundliche genetische und biochemische Werkzeuge, um mitochondriale Signalwege zu untersuchen. Eine der leistungsfähigsten Ressourcen zur Erforschung der Mechanismen des Zusammenbaus von Atemwegskomplexen und der mitochondrialen Proteinsynthese ist jedoch die Fähigkeit, Mitochondrien zu transformieren und das Genom der Organelle zu modifizieren. Früher war es hilfreich, in die mitochondriale DNA (mtDNA) Punktmutationen oder kleine Deletionen/Insertionen ^1,2,3,4,5 einzuführen, die Gene ^6,7 zu löschen, Genumlagerungen ^7,8 vorzunehmen, Epitope zu mitochondrialen Proteinen ^{hinzuzufügen 9,10}, Gene vom Zellkern in die Mitochondrien zu verlagern^11,12 und führen Reportergene wie BarStar¹³, GFP^14,15, Luciferase¹⁶ und das am weitesten verbreitete ARG8^{m 17,18} ein. Mitochondriale Genommodifikationen haben es uns ermöglicht, Mechanismen zu analysieren und zu identifizieren, die sonst schwer zu verstehen gewesen wären. Zum Beispiel war das ARG8 m-Reportergen, das am COX1-Locus in der mitochondrialen DNA eingefügt wurde, entscheidend für das Verständnis, dass Mss51 eine doppelte Rolle bei der Cox1-Biogenese spielt. Zum einen ist es ein translationaler Aktivator der COX1-mRNA und zum anderen ein Assemblierungschaperon für das neu hergestellte Cox1-Protein ^7,19. In dieser Arbeit wird eine detaillierte Methode zur Transformation von S. cerevisiae Mitochondrien vorgestellt. Obwohl das mitochondriale Transformationsprotokoll bereits früher veröffentlicht wurde 16,20,21,22,23, ist eine visuelle Annäherung durch ein Video unerlässlich, um die verschiedenen Stadien und Details der Methode gründlich zu verstehen. Die Methode besteht aus verschiedenen Schritten und gliedert sich in vier allgemeine Stufen:

Abbildung 1: Überblick über den Ablauf der mitochondrialen Transformation durch Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektilbeschuss: 1) Die Wolframpartikel werden sterilisiert und vor der DNA-Beschichtung vorbereitet. 2) Zwei verschiedene Plasmide werden auf der Oberfläche der WPs ausgefällt. Eines ist ein bakterielles Plasmid, das das Konstrukt enthält, das zur mitochondrialen Matrix geleitet wird. Der andere ist ein Expressionsvektor für Kernhefe, der einen Auxotrophiemarker trägt. 3) Ein Rezeptorhefestamm ohne mitochondriale DNA (rho⁰) wird auf einer fermentativen Kohlenstoffquelle wie Galaktose oder Raffinose gezüchtet, die keine Glukoseunterdrückung der mitochondrialen Genexpression ausübt^34,35. Die Kultur wird auf Petrischalen verteilt, die das Bombardementmedium enthalten. 4) Mit Plasmiden beschichtete WPs werden durch Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektilbeschuss auf den Rezeptorstamm geschossen. 5) Positive synthetische ^Rho-Kolonien, die das mitochondriale Plasmid enthalten, werden durch Paarung mit einem Testerstamm ausgewählt. 6) Das mitochondriale Konstrukt wird an der gewünschten Stelle in das mitochondriale Genom integriert, indem der synthetische ^Rho-Stamm (Donor) mit dem Akzeptorstamm durch einen Prozess gepaart wird, der als Zytoduktion bekannt ist. 7) Der positive Rezeptor, der haploide Stamm, der das mitochondriale Konstrukt trägt, wird selektiert und in verschiedenen Medien gereinigt. Abkürzungen: WPs = Wolframpartikel; mtDNA = mitochondriale DNA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Transformation von Zellen mit dem DNA-Konstrukt, das sich in das mitochondriale Genom integrieren soll (Abbildung 1, Schritte 1-4)
Obwohl es möglich ist, eine Hefe, die ein vollständiges mitochondriales Genom (rho⁺) enthält, direkt zu transformieren, ist die Transformation 10-20x effizienter, wenn den Zellen mitochondriale DNA (rho⁰)²⁴ fehlt. Wolframpartikel (WPs) werden mit zwei verschiedenen Plasmiden beschichtet, die co-transformiert werden. Der erste ist ein Hefe-2-μ-Expressionsvektor, der einen Auxotrophiemarker trägt, wie z. B. LEU2 oder URA3 (z. B. YEp351 bzw. YEp352). Wenn die biolistische Einführung von DNA in die Hefezellen erfolgreich ist, wachsen die Transformanten auf dem Auxotrophiemedium (d.h. einem Medium, dem Leucin oder Uracil fehlt). Dieses Plasmid ist hilfreich bei der ersten Selektion der Zellen, die das Kernplasmid erworben haben; Andernfalls würde die Anzahl der resultierenden Kolonien die Platte sättigen. Das zweite Plasmid ist ein bakterielles Plasmid (wie z.B. pBluescript oder ähnliches), das den mitochondrialen Aufbau enthält, der in das mitochondriale Genom integriert werden soll. Das Konstrukt muss mindestens 100 nt von 5′ und 3′ flankierenden mitochondrialen Sequenzen für die Rekombination mit der mitochondrialen Region von Interesse enthalten. Unserer Erfahrung nach ist es wahrscheinlicher, dass größere flankierende Sequenzen erfolgreich mit dem Ziellocus im mitochondrialen Genom rekombinieren.

Ein konkretes Beispiel ist in Abbildung 2²⁵ dargestellt. In diesem Beispiel bestand das Ziel darin, die Region des mitochondrialen COX1-Gens zu löschen, die für die letzten 15 Aminosäuren des entsprechenden Proteins (Cox1ΔC15) kodiert (Abbildung 2A). Das bakterielle Plasmid, das die COX1ΔC15-Mutation trug, enthielt 395 nt bzw. 990 nt der 5′- bzw. 3′-untranslatierten Regionen des Gens. Das Plasmid wurde von pBluescript (pXPM61) abgeleitet und zusammen mit dem 2-μ-Plasmid YEp352 auf der Oberfläche von WPs kopräzipitiert (Abbildung 2B). Die WPs wurden dann durch Mikroprojektilbeschuss in den ausgewählten Empfängerstamm eingebracht (Abbildung 2C). Dieser Stamm mit der Bezeichnung NAB69²⁶ ist ein MATa, rho^0-Stamm mit den Allelen kar1-1 und ade2 (die Bedeutung dieser Eigenschaften wird weiter unten diskutiert). Die Zellen wurden auf Bombardementmedien plattiert, denen Uracil fehlte, um diejenigen auszuwählen, die das 2-μ Plasmid erhielten (Abbildung 2C). Die Zellen wurden 5-7 Nächte lang bei 30 °C gezüchtet.

Selektion der Zellen, die das bakterielle Plasmid mit dem mitochondrialen Konstrukt und das nukleäre 2 μ Plasmid mit dem Auxotrophiemarker erworben haben (Abbildung 1, Schritt 5)
Die positiven Kolonien erhalten viele Kopien des bakteriellen Plasmids in ihren Mitochondrien²². Da die transformierten Zellen ursprünglich rho⁰ sind, unterstützen keine mitochondrialen Sequenzen die Translation des im Plasmid vorhandenen mitochondrialen Konstrukts; Daher wird das transformierte mitochondriale Gen nicht exprimiert. Es ist notwendig, die Transformanten mit einem Testerstamm zu paaren, um die Hefekolonien nachzuweisen, die das mitochondriale Plasmid erworben haben. Das mitochondriale Genom des Testerstamms enthält eine nicht-funktionelle mutierte Version des interessierenden Gens. Nach der Paarung verschmelzen die Mitochondrien, und die mitochondriale Sequenz, die in dem transformierten Plasmid enthalten ist, rekombiniert mit dem mutierten mitochondrialen Gen aus dem Testerstamm; Folglich wird die Wiederherstellung des WT-Gens die Funktion wiederherstellen. Das resultierende Diploid hat einen nachweisbaren positiven Phänotyp (in der Regel die Fähigkeit, in Atemmedien oder einem Medium ohne Arginin zu wachsen). Die positiven Zellen, die das bakterielle Plasmid in den Mitochondrien tragen, werden als “synthetische ^Rho-Zellen ” bezeichnet. Im spezifischen Beispiel von Abbildung 2D wurden synthetische ^Rho-Zellen mit dem COX1ΔC15-Konstrukt (XPM199 genannt) auf einem Medium ohne Uracil repliziert (dies ist die Master-Platte, von der positive Kolonien gereinigt wurden). Sie wurden auch auf einem Rasen des Testerstamms L45²⁷ repliziert, der die nicht-funktionelle Mutation cox1D369N enthält. Nach zweiwöchiger Paarung rekombinierte sich das mitochondriale Genom von L45 und XPM199, was zu einem funktionsfähigen COX1-Gen führte; Daher gewannen die Diploiden die Fähigkeit zurück, auf Atemwegsmedien zu wachsen. Von der Masterplatte wählten wir die positiven Kolonien aus. Sie wurden auf Platten gestreift, denen Uracil fehlte, und die selektiven Tests wurden wiederholt, um reine synthetische ^Rhozellen zu erhalten (Abbildung 2E). Es ist wichtig zu beachten, dass die Testplatte nur zur Identifizierung von synthetischen ^Rho-Kolonien dient und Mutanten aus diesen Platten nicht gewonnen werden können.

Integration des Konstrukts in das mitochondriale Genom des beabsichtigten Stammes
Dieser Schritt wird durch einen Prozess erreicht, der als Zytoduktion^{bezeichnet wird 28,29} (Abbildung 1, Schritt 6). Bei diesem Ansatz wird der synthetische ^Rho-Stamm (Donorstamm) mit dem beabsichtigten Akzeptorstamm des entgegengesetzten Paarungstyps verpaart. Eine wesentliche Voraussetzung ist, dass mindestens einer der beiden Paarungsstämme die kar1-1-Mutation trägt, um die Kernfusion^{zu behindern 30}. Daher entsteht bei der Paarung der beiden Zellen eine zweikernige Zygote (Abbildung 3). Das mitochondriale Netzwerk aus den Elternzellen (Donor und Akzeptor) verschmilzt und die mitochondrialen DNA-Moleküle rekombinieren. Die zweikernigen Zygoten werden inkubiert/zurückgewonnen, um eine Knospung zu ermöglichen, die haploide Zellen produziert. Diese Haploide tragen den Kernhintergrund einer der Elternzellen. In ähnlicher Weise können Haploide die mitochondriale DNA entweder von der Elternzelle oder von der rekombinierten mitochondrialen DNA von Interesse tragen. Die kar1-1-Mutation ist jedoch nicht zu 100 % wirksam, und während der Paarung werden einige echte Diploide gebildet^28,29. Der synthetische ^Rho-Stamm (Donor, XPM199) trug im Beispiel das kar1-1-Allel. Als selektiven Marker besaß es das ade2-Allel, was es zu einem auxotrophen Marker für Adenin machte (Abbildung 4). Der Akzeptorstamm war XPM10, ein rho⁺-Stamm mit dem cox1Δ::ARG8^m-Konstrukt, wobei der Reporter ARG8^m die COX1-Codons im mitochondrialen Genom^{ersetzte 7}. Die Mischung beider Zellkulturen wurde als Tropfen auf eine YPD-Platte gegeben, um die Paarung zu ermöglichen. Nach 3-5 Stunden wurden die Zellen unter einem Lichtmikroskop beobachtet, um die Bildung von shmoos (Abbildung 3B) zu erkennen, einer Zellform, die mit der Paarung assoziiert ist. Nach der Inkubations-/Erholungszeit wurden die zweikernigen Zygoten auf ein Medium ohne Adenin plattiert, um das Wachstum der Spenderzellen zu verhindern.

Auswahl des haploiden Stammes, der das mitochondriale Genom von Interesse trägt (Abbildung 1, Schritt 7)
Nach der Zytoduktion liegt eine Mischung aus Donor-, Akzeptor- und diploiden Zellen vor. Daher müssen die Zellen nach der Inkubation/Wiederherstellung der zweikernigen Zygoten in verschiedenen selektiven Medien gezüchtet werden, um die interessierenden Haploide zu identifizieren und zu reinigen. Die Selektionsmedien hängen von den Genotypen des Donors, den Akzeptorstämmen und dem beabsichtigten mitochondrialen Aufbau ab. Im Allgemeinen ist die Begründung für die Wahl des selektiven Mediums jedoch: i) Nach der Inkubation/Wiederherstellung wird das Zytoduktionsgemisch auf einem selektiven Medium gezüchtet, bei dem der Spenderstamm nicht wachsen kann. Im konkreten Beispiel in Abbildung 4A,B trägt der Donor (synthetischer ^Rho-Stamm) das nicht-funktionelle ade2-Allel. Daher muss die Zytoduktionsmischung auf einer mittleren Platte ohne Adenin inkubiert werden. Dies ist die Masterplatte. ii) Sobald die Kolonien gewachsen sind, wird die Master-Platte erneut auf einem Medium ohne Adenin repliziert (um eine neue Master-Platte zu erzeugen, von der aus die positiven Kolonien von Interesse gereinigt werden) und anschließend auf einem Medium, in dem nur Diploide wachsen können. Dies ist notwendig, um eine weitere versehentliche Reinigung der diploiden Kolonien zu vermeiden. Im Fall des Beispiels aus Abbildung 4C können nur Diploide auf Medien wachsen, denen Leucin fehlt. iii) Die Master-Platte wird auch auf Medien repliziert, auf denen nur die Akzeptor-Haploide wachsen, die die mitochondriale DNA von Interesse eingebaut haben. Im Beispiel von Abbildung 4C wachsen Haploide auf Atemwegsmedien, die Ethanol/Glycerin als Kohlenstoffquelle enthalten, da das Cox1ΔC15-Protein funktionsfähig ist. Der resultierende rho^+-Stamm mit der interessierenden mtDNA wurde XPM209²⁵ genannt. Die in Abbildung 2 und Abbildung 4 verwendeten Dehnungen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Abbildung 2: Diagramm, das ein spezifisches Beispiel für die mitochondriale Transformation und Selektion positiver ^Rho-Zellen beschreibt. (A) Die beabsichtigte Modifikation des mitochondrialen Genoms war eine Deletion der Region, die für die letzten 15 Aminosäuren der Cox1-Untereinheit (Cox1ΔC15) kodiert. (B) WPs wurden mit zwei Plasmiden beschichtet, um Hefezellen zu transformieren. Eines davon war das 2-μ-Plasmid Yep352, das in den Zellkern gerichtet und exprimiert wurde. Das andere war das Plasmid pXPM61, das das COX1ΔC15-Allel plus 395 nt bzw. 990 nt der COX1 5′- bzw. 3′-UTRs enthält. (C) Die WPs wurden in Zellen des Stammes NAB69 eingeführt, dem mitochondriale DNA fehlt (rho^0-Stamm). Transformantenkolonien, die aus den Bombardementplatten gewonnen wurden, wurden auf einem Medium repliziert, dem Uracil, der auxotrophe Marker des Kernplasmids YEp352, fehlte. (D) Zur Selektion der positiven Rho-Kolonien wurde die –^URA-Platte auf einem Medium repliziert, dem Uracil fehlte. Dies war die Masterplatte, von der die positiven Kolonien entnommen und isoliert wurden. Es wurde auch auf Platten mit Rich Media (YPD) und einem Rasen eines Testerstammes repliziert. Während der Paarung wurde die synthetische rhomitochondriale DNA mit der mitochondrialen DNA des Testerstamms L45²⁷ rekombiniert, der eine Mutation im COX1-Gen (D369N) trägt. Die Diploide, die auf Atemmedien wuchsen, enthielten die transformierte DNA. Die entsprechenden Kolonien wurden von der Master-Platte entnommen, um sie zu restaurieren und zu reinigen. Um die positiven Kolonien in der Masterplatte bei allen Replikationen zu identifizieren, wurden an den Rändern der Platten (grüne Linien) Markierungen mit einem Permanentmarker angebracht. (E) Die ausgewählten positiven Kolonien wurden auf einem Medium ohne Uracil regeneriert. Das war die neue Masterplatte. Wie in D wurden zwei weitere Testrunden durchgeführt, um die synthetischen Rhokolonien zu reinigen. Abkürzungen: WPs = Wolframpartikel; mtDNA = mitochondriale DNA; -URA/Sorb = Mangel an Uracil/ Sorbitol enthaltend; WT = Wildtyp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Diagramm, das den Ablauf der Zytoduktion beschreibt. (A) Allgemeiner Überblick darüber, wie sich Zellen während der Zytoduktion paaren. Während der Zytoduktion verschmelzen die Mitochondrien der Donor- und Akzeptorstämme, so dass die mitochondriale DNA beider Stämme rekombiniert. Da die Kernfusion aufgrund der kar1-1-Mutation ³⁰ reduziert ist, bilden sich zweikernige Zygoten. Nach einiger Inkubations-/Erholungszeit werden die binukleären Zygotenknospen und haploiden Akzeptoren ausgewählt, die die beabsichtigte mitochondriale Mutation enthalten. (B) Die Paarung des synthetischen ^Rho-Stammes (Donor) und des Akzeptorstamms durch Zytoduktion ermöglicht die Bildung von shmoos (rote Pfeile), einer charakteristischen Form der Paarungshefe. Das Bild wurde unter einem Lichtmikroskop mit einem 100-fachen Objektiv aufgenommen. Maßstabsleiste = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Diagramm, das ein spezifisches Beispiel für eine Zytoduktion zur Integration der Mutation COX1ΔC15 in das mitochondriale Genom beschreibt. (A) Flüssigkulturen des synthetischen ^Rho-Stammes (Donor, XPM199) und des interessierenden Stammes (Akzeptor, XPM10) wurden gemischt, um sich zu paaren. Nach der Shmoo-Bildung wurde die Mischung 2-4 Stunden lang in einer Flüssigkultur zurückgewonnen. Als nächstes wurde die Zytoduktionsmischung auf einer Platte mit einem Medium ohne Adenin verteilt, um das Wachstum der Spenderzellen zu verhindern. (B) Schematische Darstellung der Rekombinationsereignisse der mitochondrialen DNA aus dem Donor (XPM199) und dem Akzeptor (XPM10) während der Zytoduktion. (C) Die Master-Platte wurde auf verschiedenen selektiven Medien repliziert, um diejenigen Haploide zu identifizieren und zu reinigen, die das beabsichtigte mitochondriale Gen in die DNA der Organelle integriert haben (XPM209)²⁵. Abkürzungen: -ADE = fehlendes Adenin; -LEU = fehlendes Leucin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.