O protocolo aqui fornecido descreve as etapas detalhadas para a realização de estudos de eficácia de medicamentos em um modelo bioluminescente da infecção por Trypanosoma cruzi , com foco na aquisição, análise e interpretação de dados. Procedimentos de solução de problemas e controle de qualidade para minimizar problemas técnicos também são fornecidos.
Para controlar e diminuir o impacto na saúde pública de doenças de protozoários humanos, como doença de Chagas, leishmaniose e tripanossomíase humana africana, é necessário acelerar o desenvolvimento de novos medicamentos e vacinas. No entanto, esse processo está repleto de dificuldades, como biologia de parasitas altamente complexos e patogênese de doenças e, como típico de doenças tropicais negligenciadas, financiamento comparativamente limitado para pesquisa e desenvolvimento. Assim, modelos de estudo in vitro e in vivo que possam reproduzir suficientemente as principais características da infecção e da doença, ao mesmo tempo em que fornecem uso racional de recursos, são essenciais para o progresso da pesquisa para essas condições. Um exemplo é o modelo de camundongo de imagem de bioluminescência in vivo (BLI) para a doença de Chagas, que fornece detecção altamente sensível de luz de comprimento de onda longo gerada por parasitas Trypanosoma cruzi que expressam luciferase. Apesar dessa técnica se tornar a abordagem padrão para estudos de eficácia de medicamentos in vivo , os grupos de pesquisa ainda podem ter dificuldades para implementá-la devido à falta de treinamento prático adequado sobre manuseio de equipamentos e aplicação de procedimentos de controle de qualidade, mesmo quando o equipamento BLI adequado está prontamente disponível. Considerando esse cenário, este protocolo visa orientar desde o planejamento de experimentos até a aquisição e análise de dados, com detalhes que facilitem a implementação de protocolos em grupos de pesquisa com pouca ou nenhuma experiência com BLI, seja para doença de Chagas ou para outros modelos de camundongos infectologistas.
A doença de Chagas é endêmica na América Latina e afeta aproximadamente sete milhões de pessoas em todo o mundo1. Anualmente, mais de 50.000 mortes e perdas econômicas de cerca de 7 bilhões de dólares resultam da natureza incapacitante dessa doença2. A doença de Chagas é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, um parasita hemoflagelado heteroxênico capaz de infectar mamíferos (silvestres e domésticos) e triatomíneos vetores (Hemiptera, Reduviidae)3 nas Américas, onde a transmissão vetorial é estabelecida. Outras vias importantes de infecção incluem transfusão de sangue, transplante de órgãos, transmissão oral (pela ingestão de alimentos contaminados com um triatomíneo infectado)4 e transmissão congênita. As vias de transmissão não vetoriais têm contribuído para a disseminação da doença de Chagas para áreas não endêmicas 3,5.
A doença de Chagas se manifesta em duas fases clínicas. A fase aguda é, na maioria dos casos, assintomática. As infecções sintomáticas geralmente estão associadas a sinais inespecíficos, como febre, fadiga, mialgia, linfadenopatia, esplenomegalia e hepatomegalia. A fase aguda também está frequentemente associada à parasitemia patente e à circulação sistêmica de parasitas. O óbito pode ocorrer em até 10% dos casos diagnosticados, principalmente nos de infecção oral6. A fase crônica é frequentemente caracterizada por um longo período de ausência de quaisquer sintomas. Com o tempo, aproximadamente um terço dos pacientes infectados décadas antes apresenta manifestações cardíacas, geralmente acompanhadas de fibrose e inflamação miocárdica, e/ou distúrbios gastrointestinais relacionados principalmente ao desenvolvimento de síndromes de megaesôfago e/ou megacólon 3,5,6.
O tratamento etiológico da doença de Chagas consiste em apenas duas drogas: benznidazol e nifurtimox. Esses agentes antiparasitários estão disponíveis há mais de 50 anos e têm toxicidade considerável e eficácia limitada 5,7,8. Consequentemente, há uma necessidade premente de desenvolver tratamentos novos, seguros e mais eficazes para pacientes com doença de Chagas.
Técnicas mais sofisticadas e precisas possibilitam agora a obtenção de respostas para velhas perguntas que permitem avanços na busca de novos tratamentos para a doença de Chagas. Nesse sentido, a comunidade científica se beneficia muito dos parasitas geneticamente modificados para estudos in vivo sobre o curso da infecção e avaliação da eficácia dos medicamentos 9,10,11,12. Um ensaio longitudinal baseado no sistema de imagem de bioluminescência (BLI) permite a avaliação da eficácia durante e após o esquema de tratamento, levando à identificação de compostos com atividade tripanocida10,13. O método BLI fornece uma medição direta da carga parasitária, tanto em circulação quanto em tecidos e órgãos, por meio da quantificação da luz produzida pela linhagem geneticamente modificada T. cruzi CL Brener Luc::Neon11, que expressa constitutivamente a luciferase do vaga-lume12.
No entanto, quase 10 anos após o estabelecimento do modelo animal BLI da doença de Chagas e estudos de eficácia de drogas, apenas alguns grupos de pesquisa dominam essa técnica. Esse fato se deve não apenas ao acesso reduzido a equipamentos de imagem adequados, mas também à falta de treinamento e disponibilidade de protocolos estruturados e detalhados. Este método apresenta várias vantagens em relação a outras abordagens, que dependem da avaliação da parasitemia por microscopia, sorologia ou avaliação de infecção de órgãos/tecidos por qPCR para detecção de DNA do parasita, pois permite melhorar o bem-estar de camundongos e reduzir o uso de animais pela possibilidade de geração de dados mais robustos e integrados in vivo. Além disso, esse método é, sem dúvida, mais sensível, pois permite a detecção imediata de focos parasitários em órgãos viscerais após o tratamentomedicamentoso 10,12. Portanto, este protocolo visa orientar os grupos de pesquisa em Parasitologia e outras doenças infecciosas a estabelecerem essa metodologia em seus laboratórios, detalhando os procedimentos técnicos. Aqui, compartilhamos a experiência obtida com a implementação do modelo BLI da doença de Chagas no Brasil, o primeiro do gênero na América Latina, como parte dos esforços de descoberta de medicamentos coordenados pela iniciativa Medicamentos para Doenças Negligenciadas (DNDi).
A imagem de bioluminescência é um método inovador que permite a detecção de um gene de relatório usando um espectro visível e infravermelho de radiação eletromagnética. Portanto, não há necessidade de marcadores radiomarcados para rastrear sua amostra35. O BLI é adequado para modelos de roedores e outras espécies pequenas. É muito útil para estudos pré-clínicos porque é mais seguro e permite várias rodadas de imagem, causando o mínimo de desconforto ao animal. Além disso, a imagem in vivo é muito flexível devido à possibilidade de combinar bioluminescência, fluorescência e outras técnicas, como a tomografia por emissão de pósitrons36.
A imagem óptica é governada por propriedades físicas ópticas, como absorção e espalhamento. Todos os tecidos absorvem e espalham luz de comprimentos de onda distintos de maneira diferente37. Um passo crítico é selecionar um gene repórter sem levar em conta o comprimento de onda emitido da luz produzida pela reação química. Embora um nível de expressão do gene repórter possa ser alto in vitro em ensaios bioluminescentes, os mesmos níveis de expressão podem não ser alcançados ao progredir para o ambiente in vivo. Neste protocolo, usamos a versão otimizada para códon de Photinus pyralis luciferase (PpyRE9H)38 com desvio para o vermelho para tripanossomatídeos9, que emite luz a 617 nm, uma das mais adequadas para estudos in vivo 39. Comprimentos de onda maiores que 600 nm são menos absorvidos e espalhados pelos cromóforos endógenos do corpo, especialmente hemoglobina e melanina. Assim, as luzes vermelhas podem ser transmitidas através de vários centímetros de tecido, permitindo que os fótons cheguem à câmera CCD mesmo de dentro dos tecidos viscerais39,40.
Uma área de preocupação em ambientes de imagem é a falta de uma compreensão abrangente de sua função e efeitos. Binning, uma técnica de pré-processamento, combina as informações adquiridas por detectores contíguos em um pixel maior. Esse processo melhora a relação sinal-ruído, reduzindo o ruído de fundo e melhorando a sensibilidade. No entanto, diminui a precisão da resolução espacial, resultando em uma imagem pixelada41,42. Essa compensação é uma consideração importante em sua estratégia de imagem.
Com base no Perfil do Produto Alvo e no Perfil do Candidato Alvo para a doença de Chagas34, o estudo de prova de conceito está focado na sensibilidade para detectar o T. cruzi e ajudar a estabelecer se um novo candidato a medicamento pode alcançar uma cura estéril (representada pela falta de recidiva após várias rodadas de imunossupressão). Portanto, executamos o BLI usando o fator de binning mais alto sem supersaturar a imagem. Quando a imagem supersatura, uma nova aquisição é realizada usando um fator de binning mais baixo. Durante a análise, uma correção matemática é aplicada às imagens que exigiram binning diferente. Dessa forma, os dados finais devem ser apresentados usando o mesmo binning. A Tabela 1 demonstra os diferentes valores obtidos quando fatores binning distintos foram aplicados na mesma imagem e ROIs.
Tabela 1: Influência das configurações de binning na quantificação do BLI. Quantificação de três ROIs na imagem do modelo agudo (d13) e do modelo crônico (d118), analisadas em diferentes fatores binning. Clique aqui para baixar esta tabela.
Devido ao cenário atual da doença de Chagas na clínica, os esforços de descoberta de medicamentos visam eliminar completamente os parasitas (cura parasitológica)27,34. Portanto, o protocolo pré-clínico in vivo inclui abordagens que superam as limitações da sensibilidade técnica do BLI. Uma das abordagens é tratar os camundongos com ciclofosfamida para diminuir a resposta imune que controla a carga parasitária. Outra estratégia é diminuir a profundidade do tecido e remover camadas de músculos, pele e pêlo que obstruem o caminho da luz para a câmera. Através do procedimento ex vivo, pequenas manchas bioluminescentes podem ser detectadas, revelando focos parasitários abaixo do limiar de BLI in vivo, como mostrado na Figura 5C em resultado ex vivo de camundongo tratado por Posa.
Projetar um experimento piloto para avaliar o próprio modelo e a dinâmica da infecção é crucial para estabelecer um experimento preciso para a avaliação da eficácia do medicamento antiparasitário. Assim, o pesquisador poderá definir as configurações adequadas de BLI e o curso do tempo de infecção com antecedência. Em um experimento exploratório, uma ferramenta que pode ser útil para definir as configurações de aquisição é a ‘Exposição automática’. Com essa ferramenta, o pesquisador estabelece a prioridade de três configurações (Tempo de exposição, Binning e F/Stop) para adquirir a melhor imagem possível. Em particular, o pesquisador deve garantir que as imagens sejam adquiridas dentro da faixa dinâmica da câmera CCD, sem supersaturação ou subexposição, o que pode ser verificado através dos limites mínimo e máximo da escala e do recurso de autoexposição (Menu Editar > Preferências > Aquisição de Guias > Exposição Automática de Abas). Nesse protocolo, a abertura da câmera foi ajustada no valor máximo (F/Stop: 1), e diferentes tempos de exposição e fatores binning foram definidos para modelos agudos e crônicos. Essas configurações fornecem previsibilidade de tempo para executar diferentes rodadas de imagem simultaneamente. Considerando que o método repórter é baseado em uma reação enzimática, tanto a biodistribuição do substrato no camundongo quanto a cinética da luciferase influenciam o sinal bioluminescente e, portanto, a quantificação da infecção (Figura 1B). Consequentemente, a aquisição de imagens em diferentes momentos da cinética enzimática introduz variabilidade de dados que não pode ser contabilizada ou corrigida e afeta o cálculo do fluxo total (fótons/segundo) ou radiância (fótons/segundo/cm2/esterradiano). Além disso, a infecção por T. cruzi exibe posicionamento espacial dinâmico em camundongos (diferentes áreas e tecidos, profundidade e carga parasitária). Portanto, estabelecer um valor de contagens a serem adquiridas pode perder fontes de sinal mais fracas (baixo número de parasitas em um determinado ponto mais profundo do tecido) se a fonte de outro sinal mais forte atender aos critérios de auto-exposição definidos.
Um recurso complicado do software Living Image é exibir a imagem adquirida em uma escala de cores automática. Não há opção para pré-definir a escala para exibir automaticamente uma nova imagem adquirida de acordo com os valores de escala selecionados (consulte a etapa 6.2 do protocolo). Essa situação obriga o pesquisador a alterar manualmente as imagens, uma a uma, para os valores máximos e mínimos escolhidos. Como consequência, os usuários não experientes e não bem treinados não têm a leitura adequada durante a sessão de aquisição e podem enganar os dados ou perder informações importantes naquele momento. Para isso, o experimento piloto é benéfico.
Uma das perguntas mais comuns sobre o projeto do experimento de prova de conceito é como escolher a duração e a dose do tratamento. Para novas entidades químicas, esses parâmetros são geralmente definidos pela potência e seletividade do composto in vitro, em combinação com dados gerados pelo metabolismo e farmacocinética do medicamento (DMPK) e estudos de tolerabilidade conduzidos antes do teste in vivo para eficácia. Em resumo, após a identificação de compostos capazes de matar seletivamente o parasita no interior das células, os primeiros experimentos de ADME (absorção, distribuição, metabolismo e excreção) são realizados in vitro para estimar a solubilidade aquosa dos compostos, a permeabilidade celular e a estabilidade metabólica, entre outros parâmetros. Se os compostos mostrarem um bom equilíbrio de propriedades in vitro (geralmente definidas em perfis de candidatos-alvo), então esses candidatos são progredidos para estudos de farmacocinética in vivo (PK) em camundongos saudáveis, que descrevem a exposição do composto no sangue (e possivelmente também nos tecidos) e fornecem uma ideia geral da tolerabilidade em diferentes níveis de dose17, 34,43. Idealmente, o objetivo da avaliação farmacocinética na maioria das doenças infecciosas é determinar a viabilidade de atingir concentrações plasmáticas livres (corrigidas para ligação às proteínas plasmáticas) que estão acima das concentrações EC50 / EC90 44 – a concentração efetiva que mata ou pelo menos inibe o crescimento de 50% ou 90% dos parasitas, respectivamente – por um período de tempo suficientemente longo. Se for alcançada exposição suficiente em um determinado nível de dose, esse regime pode ser usado durante os estudos de eficácia usando o modelo Chagas BLI. Para estudos de reposicionamento de medicamentos, devem estar disponíveis dados farmacocinéticos in vitro e in vivo. Um bom começo para o reperfilamento de medicamentos são os bancos de dados químicos, como o PubChem45, que fornecem dados reconhecidos que podem ser convertidos em camundongos usando escala alométrica46 para estimar regimes de tratamento seguros e não tóxicos a serem testados. No entanto, nem sempre é esse o caso. Os estudos de PK ainda são um campo negligenciado na ciência acadêmica, e poucas empresas farmacêuticas publicam seus resultados de PK. A comunidade científica de descoberta de medicamentos recomenda incluir a avaliação farmacocinética in vivo junto com ensaios de eficácia de medicamentos (farmacodinâmica)47. Portanto, a imagem pré-clínica é compatível com medições compostas simultaneamente, e essa abordagem associada aumenta a robustez dos dados.
Além disso, o manuseio, o peso e as condições de saúde dos camundongos são monitorados durante todo o experimento. Sinais de toxicidade e efeitos colaterais, como curvatura, tremor, perda de equilíbrio, falta de vontade de se mover, relutância em alimentar ou beber, prostração ou quaisquer outras anormalidades presentes no grupo ou por condições individuais de camundongos, devem ser registrados e relatados em estudos pré-clínicos. Um dos objetivos da imagem óptica é garantir o bem-estar dos animais. Assim, os parâmetros humanos devem ser aplicados em camundongos com sinais de dor descritos na escala ‘Grimace48. Além disso, os camundongos foram pesados semanalmente durante a aquisição do BLI e, mais frequentemente, durante a dosagem do medicamento e o tratamento com CTX. Seguindo os regulamentos de bem-estar animal, os camundongos que perdem mais de 20% do peso corporal devem ser imediatamente sacrificados humanamente.
O modelo bioluminescente do T. cruzi é hoje o modelo experimental de última geração para a descoberta e desenvolvimento de novos tratamentos para a doença de Chagas. Modelo que replica as principais características da infecção por T. cruzi e da doença de Chagas49, permitindo o monitoramento em tempo real da parasitemia e a diferenciação de compostos com perfis de eficácia variados associados a modos de ação conhecidos. O BLI é uma técnica que aumenta a assertividade na identificação de tecidos infectados. Permite a seleção precisa de tecidos infectados para serem utilizados em uma ampla gama de abordagens, incluindo todos os métodos clássicos já aplicados na pesquisa do T. cruzi 50,51. Além disso, permite que os pesquisadores explorem tecnologias de ponta e desenvolvam novas33. Além disso, o BLI proporciona melhoria do bem-estar animal e uso mais racional de acordo com os princípios dos 3Rs10,35, tudo de uma só vez.
Vários grupos de pesquisa focados em doenças tropicais negligenciadas são colocados em países onde os dispositivos de imagem in vivo não estão disponíveis. Para superar o cenário atual, novas redes internacionais como a Global BioImaging e seus consórcios associados promovem ações para fornecer acesso aberto às instalações centrais de imagem e melhorar a formação de pessoal e cientistas de imagem 52,53. Essas iniciativas, juntamente com protocolos de usuário amigáveis como este, podem oferecer condições que democratizam tecnologias de ponta para todos os pesquisadores. A implementação desse método na descoberta pré-clínica de medicamentos ofereceu uma sólida leitura de eficácia e valor preditivo do resultado clínico, facilitando a descoberta de medicamentos para a doença de Chagas.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem a Amanda Franscisco, John Kelly e Fanny Escudié por fornecerem treinamento e suporte ao BLI em ensaios de eficácia de medicamentos, John Kelly e Simone Calderano por fornecerem parasitas e Gabriel Padilla pelo apoio em estudos com animais. A.C.S recebeu uma bolsa CAPES PSDE para treinamento na London School of Hygiene and Tropical Medicine (Reino Unido). Os autores também gostariam de agradecer à Plataforma de Pesquisa em Citometria de Fluxo e Imagem (FLUIR) do Centro de Pesquisa Científica da Universidade de São Paulo (CEFAP-USP) pelo apoio técnico na análise do equipamento IVIS Spectrum, e ao Laboratório de Genética e Controle Sanitário ICB-USP pelos ensaios pós-experimentação para controle de qualidade de camundongos como livres de patógenos específicos. Este projeto foi financiado pela DNDi. A DNDi agradece aos seus doadores, públicos e privados, que forneceram financiamento para todas as atividades da DNDi desde sua criação em 2003. Uma lista completa dos doadores da DNDi pode ser encontrada em https://dndi.org/about/donors/.
BD LSRFortessa™ X-20 Cell Analyzer | BD Biosciences | ||
Weighing Balance (animal facility) | Available from several suppliers | ||
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Revvity (former PerkinElmer) | ||
FlowJ Software v10.7.1 | BD Biosciences | ||
Living Image Software for Spectrum v4.7.1 | Revvity (former PerkinElmer) | License Free Analysis Software called 'Aura Imaging' could be used for the most basic features provided by Spectral Instruments Imaging (Bruker company) (https://spectralinvivo.com/software/) | |
Microsoft Office software | Microsoft | ||
GraphPad Prism v8.4.0 | GraphPad Software Inc. | ||
DMEM Low Glucose | Vitrocell | D0025 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
Foetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Trypsin 0.5% EDTA | Gibco | 25300-062 | |
LIT medium | In house | ||
Hygromycin B (50 mg/mL) | Gibco | 10687010 | |
Grace′s Insect Medium | Sigma-Aldrich | G9771 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | |
IVISBrite d-luciferin potassium salt | Revvity (former PerkinElmer) | 122799 | Also could be used: VivoGlo Luciferin, in vivo grade (Promega/P1043); D-Luciferin, Monopotassium Salt (Thermo Scientific/88293) or PierceD-Luciferin, Monosodium* Salt (Thermo Scientific/88291); D-Luciferin, Potassium Salt (GoldBio/LUCK or eLUCK); D-Luciferin, Sodium* Salt (GoldBio/LUCNA or eLUCNA) *Sodium or potassium salt differences relies minimal chances on solubility, however do not affect in vivo performance. |
DPBS | Gibco | 21600-044 | |
Cyclophosphamide (CTX) | Sigma-Aldrich | C0768-5g | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879 | |
(Hydroxypropyl)methyl cellulose (HPMC) | Sigma-Aldrich | 09963-25G | |
Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | 402834 | |
Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754-1L | |
Benznidazole | ELEA | ||
Posaconazole (Noxafil commercial formulation) | Schering-Phough | ||
Giemsa | Available from several suppliers | ||
gavage needle (stainless-steel straight) – 22GA | Aton | CA2003 | |
1 mL Syringe and 31G needle | Available from several suppliers | ||
1 mL Syringe and removable 26G needle | Available from several suppliers | ||
1 mL Syringe and removable 24G X¾ needle | Available from several suppliers | ||
Sterile Syringe Filter 0.2 µm | Available from several suppliers | ||
A4 Matte Black paper 120gr or thicker | Paper Color/ Canson (Available from several suppliers) | ||
aluminum foil | Available from several suppliers | ||
Neubauer chamber | Available from several suppliers |
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