Il protocollo qui fornito descrive i passaggi dettagliati per eseguire studi di efficacia dei farmaci in un modello bioluminescente di infezione da Trypanosoma cruzi , con particolare attenzione all’acquisizione, all’analisi e all’interpretazione dei dati. Vengono inoltre fornite procedure di risoluzione dei problemi e controllo qualità per ridurre al minimo i problemi tecnici.
Per controllare e ridurre l’impatto sulla salute pubblica delle malattie dei protozoi umani come la malattia di Chagas, la leishmaniosi e la tripanosomiasi africana umana, è necessario accelerare lo sviluppo di nuovi farmaci e vaccini. Tuttavia, questo processo è pieno di difficoltà come la biologia dei parassiti altamente complessa e la patogenesi delle malattie e, come tipico per le malattie tropicali trascurate, finanziamenti relativamente limitati per la ricerca e lo sviluppo. Pertanto, i modelli di studio in vitro e in vivo in grado di riprodurre in modo sufficiente le caratteristiche chiave dell’infezione e della malattia, fornendo al contempo un uso razionale delle risorse, sono essenziali per far progredire la ricerca per queste condizioni. Un esempio è il modello murino di imaging a bioluminescenza (BLI) in vivo per la malattia di Chagas, che fornisce un rilevamento altamente sensibile della luce a lunga lunghezza d’onda generata dai parassiti Trypanosoma cruzi che esprimono luciferasi. Nonostante questa tecnica sia diventata l’approccio standard per gli studi in vivo sull’efficacia dei farmaci, i gruppi di ricerca potrebbero ancora avere difficoltà ad implementarla a causa della mancanza di un’adeguata formazione pratica sulla gestione delle apparecchiature e sull’applicazione delle procedure di controllo della qualità, anche quando sono prontamente disponibili apparecchiature BLI adeguate. Considerando questo scenario, questo protocollo mira a guidare dalla pianificazione degli esperimenti all’acquisizione e all’analisi dei dati, con dettagli che facilitano l’implementazione di protocolli in gruppi di ricerca con poca o nessuna esperienza con BLI, sia per la malattia di Chagas che per altri modelli murini di malattie infettive.
La malattia di Chagas è endemica in America Latina e colpisce circa sette milioni di persone in tutto il mondo1. Ogni anno, più di 50.000 decessi e perdite economiche di circa 7 miliardi di dollari derivano dalla natura invalidante di questa malattia2. La malattia di Chagas è causata dal protozoo Trypanosoma cruzi, un parassita emoflagellato eterossonico in grado di infettare i mammiferi (selvatici e domestici) e i vettori di triatomine (Hemiptera, Reduviidae)3 nelle Americhe, dove è stabilita la trasmissione vettoriale. Altre importanti vie di infezione includono la trasfusione di sangue, il trapianto di organi, la trasmissione orale (mediante l’ingestione di cibo contaminato da una triatomina infetta)4 e la trasmissione congenita. Le vie di trasmissione non vettoriali hanno contribuito alla diffusione della malattia di Chagas in aree non endemiche 3,5.
La malattia di Chagas si manifesta in due fasi cliniche. La fase acuta è, nella maggior parte dei casi, asintomatica. Le infezioni sintomatiche sono solitamente associate a segni aspecifici come febbre, affaticamento, mialgia, linfoadenopatia, splenomegalia ed epatomegalia. La fase acuta è spesso associata anche a parassitemia pervietà e circolazione sistemica dei parassiti. La morte può verificarsi fino al 10% dei casi diagnosticati, soprattutto in quelli di infezione orale6. La fase cronica è spesso caratterizzata da un lungo periodo di assenza di qualsiasi sintomo. Con il tempo, circa un terzo dei pazienti infettati decenni prima presenta manifestazioni cardiache, solitamente accompagnate da fibrosi e infiammazione miocardica, e/o disturbi gastrointestinali per lo più correlati allo sviluppo di sindromi megaesofaghe e/o megacolon 3,5,6.
Il trattamento eziologico della malattia di Chagas consiste in due soli farmaci: benznidazolo e nifurtimox. Questi agenti antiparassitari sono disponibili da oltre 50 anni e hanno una notevole tossicità e un’efficacia limitata 5,7,8. Di conseguenza, c’è un urgente bisogno di sviluppare trattamenti nuovi, sicuri e più efficaci per i pazienti affetti dalla malattia di Chagas.
Tecniche più sofisticate e accurate permettono ora di ottenere risposte a vecchie domande che permettono di avanzare nella ricerca di nuovi trattamenti per la malattia di Chagas. In questo senso, la comunità scientifica trae grande beneficio dai parassiti geneticamente modificati per studi in vivo sul decorso dell’infezione e valutazione dell’efficacia dei farmaci 9,10,11,12. Un saggio longitudinale basato sul sistema di imaging a bioluminescenza (BLI) consente di valutare l’efficacia durante e dopo il regime di trattamento, portando all’identificazione di composti con attività tripanocida10,13. Il metodo BLI fornisce una misurazione diretta della carica parassitaria, sia in circolo che nei tessuti e negli organi, attraverso la quantificazione della luce prodotta dal lignaggio geneticamente modificato T. cruzi CL Brener Luc::Neon11, che esprime costitutivamente la luciferasi12 della lucciola spostata verso il rosso.
Ciononostante, quasi 10 anni dopo l’istituzione del modello animale BLI della malattia di Chagas e degli studi sull’efficacia dei farmaci, solo pochi gruppi di ricerca dominano questa tecnica. Questo fatto è dovuto non solo al ridotto accesso ad apparecchiature di imaging adeguate, ma anche alla mancanza di formazione e disponibilità di protocolli strutturati e dettagliati. Questo metodo presenta diversi vantaggi rispetto ad altri approcci, che si basano sulla valutazione della parassitemia mediante microscopia, sierologia o valutazione delle infezioni di organi/tessuti mediante qPCR per il rilevamento del DNA del parassita, in quanto consente di migliorare il benessere dei topi e ridurre l’uso di animali grazie alla possibilità di generare dati più robusti e integrati in vivo. Inoltre, questo metodo è, probabilmente, più sensibile, in quanto consente di rilevare prontamente i focolai di parassiti negli organi viscerali dopo il trattamento farmacologico10,12. Pertanto, questo protocollo mira a guidare i gruppi di ricerca sulla parassitologia e altre malattie infettive a stabilire questa metodologia nei loro laboratori, dettagliando le procedure tecniche. In questo articolo, condividiamo l’esperienza ottenuta attraverso l’implementazione del modello BLI della malattia di Chagas in Brasile, il primo del suo genere in America Latina, nell’ambito degli sforzi di scoperta di farmaci coordinati dall’iniziativa Drugs for Neglected Diseases (DNDi).
L’imaging a bioluminescenza è un metodo innovativo che consente il rilevamento di un gene referto utilizzando uno spettro visibile e infrarosso di radiazione elettromagnetica. Pertanto, non sono necessari marcatori radiomarcati per tracciare il campione35. BLI è adatto per modelli di roditori e altre piccole specie. È molto utile per gli studi preclinici perché è più sicuro e consente diversi cicli di immagini, causando il minimo disagio all’animale. Inoltre, l’imaging in vivo è molto flessibile grazie alla possibilità di combinare bioluminescenza, fluorescenza e altre tecniche come la tomografia a emissione di positroni36.
L’imaging ottico è governato da proprietà fisiche ottiche, come l’assorbimento e la diffusione. Tutti i tessuti assorbono e diffondono la luce di lunghezze d’onda distinte in modo diverso37. Un passaggio critico è la selezione di un gene reporter senza tenere conto della lunghezza d’onda emessa della luce prodotta dalla reazione chimica. Mentre un livello di espressione genica reporter può essere elevato in vitro nei saggi bioluminescenti, gli stessi livelli di espressione possono non essere raggiunti quando si passa al contesto in vivo. In questo protocollo, abbiamo utilizzato la versione ottimizzata per il codone di Photinus pyralis luciferase (PpyRE9H)38 per i tripanosomatidi9, che emette luce a 617 nm, una delle più adatte per gli studi in vivo 39. Le lunghezze d’onda più lunghe di 600 nm sono meno assorbite e disperse dai cromofori endogeni del corpo, in particolare l’emoglobina e la melanina. Pertanto, le luci rosse possono essere trasmesse attraverso diversi centimetri di tessuto, consentendo ai fotoni di raggiungere la telecamera CCD anche dall’interno dei tessuti viscerali39,40.
Un’area di preoccupazione nelle impostazioni di imaging è la mancanza di una comprensione completa della loro funzione e dei loro effetti. Il binning, una tecnica di pre-elaborazione, combina le informazioni acquisite dai rilevatori contigui in un pixel più grande. Questo processo migliora il rapporto segnale/rumore, riducendo il rumore di fondo e migliorando la sensibilità. Tuttavia, diminuisce la precisione della risoluzione spaziale, risultando in un’immagine pixelata41,42. Questo compromesso è una considerazione importante nella strategia di imaging.
Sulla base del profilo del prodotto target e del profilo del candidato target per la malattia di Chagas34, lo studio proof-of-concept si concentra sulla sensibilità per rilevare T. cruzi e aiutare a stabilire se un nuovo farmaco candidato può raggiungere una cura sterile (rappresentata dalla mancanza di recidiva dopo diversi cicli di immunosoppressione). Pertanto, eseguiamo il BLI utilizzando il fattore di binning più alto senza sovrasaturare l’immagine. Quando l’immagine è sovrasatura, viene eseguita una nuova acquisizione utilizzando un fattore di binning inferiore. Durante l’analisi, viene applicata una correzione matematica alle immagini che hanno richiesto un binning diverso. In questo modo, i dati finali dovrebbero essere presentati utilizzando lo stesso binning. La tabella 1 mostra i diversi valori ottenuti quando sono stati applicati fattori di binning distintivi nella stessa immagine e ROI.
Tabella 1: Influenza delle impostazioni di binning sulla quantificazione BLI. Quantificazione di tre ROI sull’immagine del modello acuto (d13) e del modello cronico (d118), analizzati in diversi fattori di binning. Clicca qui per scaricare questa tabella.
A causa dell’attuale scenario della malattia di Chagas in clinica, gli sforzi di scoperta di farmaci mirano a eliminare completamente i parassiti (cura parassitologica)27,34. Pertanto, il protocollo preclinico in vivo include approcci che superano i limiti della sensibilità tecnica del BLI. Uno degli approcci consiste nel trattare i topi con ciclofosfamide per ridurre la risposta immunitaria che controlla il carico di parassiti. Un’altra strategia consiste nel ridurre la profondità dei tessuti e rimuovere gli strati di muscoli, pelle e pelo che ostruiscono il percorso della luce verso la fotocamera. Attraverso la procedura ex vivo, è possibile rilevare piccole macchie bioluminescenti, rivelando focolai di parassiti al di sotto della soglia BLI in vivo, come mostrato nella Figura 5C nel risultato ex vivo del topo trattato con Posa.
La progettazione di un esperimento pilota per valutare il modello stesso e le dinamiche dell’infezione è fondamentale per stabilire un esperimento accurato per la valutazione dell’efficacia dei farmaci antiparassitari. Pertanto, il ricercatore sarà in grado di definire in anticipo le impostazioni BLI corrette e il decorso del tempo di infezione. In un esperimento esplorativo, uno strumento che può essere utile per definire le impostazioni di acquisizione è l'”Autoesposizione”. Con questo strumento, il ricercatore stabilisce la priorità di tre impostazioni (Tempo di esposizione, Binning e F/Stop) per acquisire la migliore immagine possibile. In particolare, il ricercatore dovrebbe assicurarsi che le immagini siano acquisite all’interno della gamma dinamica della camera CCD, senza sovrasaturazione o sottoesposizione, che possono essere verificate attraverso i limiti minimo e massimo della scala e della funzione di esposizione automatica (Menu Modifica > Preferenze > Scheda Acquisizione > Scheda Esposizione automatica). In questo protocollo, l’apertura della fotocamera è stata impostata al valore massimo (F/Stop: 1) e sono stati definiti diversi tempi di esposizione e fattori di binning per i modelli acuti e cronici. Queste impostazioni offrono la prevedibilità del tempo per eseguire diversi cicli di immagini contemporaneamente. Considerando che il metodo reporter si basa su una reazione enzimatica, sia la biodistribuzione del substrato nel topo che la cinetica della luciferasi influenzano il segnale bioluminescente e, quindi, la quantificazione dell’infezione (Figura 1B). Di conseguenza, l’acquisizione di immagini in diversi momenti della cinetica enzimatica introduce una variabilità dei dati che non può essere considerata o corretta e influisce sul calcolo del flusso totale (fotoni/secondo) o della radianza (fotoni/secondo/cm2/steradiante). Inoltre, l’infezione da T. cruzi mostra un posizionamento spaziale dinamico nei topi (diverse aree e tessuti, profondità e carico di parassiti). Quindi, stabilire un valore di conteggi da acquisire potrebbe perdere le fonti di segnale più deboli (basso numero di parassiti in un determinato punto più profondo del tessuto) se la fonte di un altro segnale più forte soddisfa i criteri di auto-esposizione definiti.
Una caratteristica complessa del software Living Image è la visualizzazione dell’immagine acquisita in una scala di colori automatica. Non è possibile preimpostare la scala per visualizzare automaticamente un’immagine acquisita nuova di zecca in base ai valori della scala selezionati (vedere il passaggio 6.2 del protocollo). Questa situazione costringe il ricercatore a modificare manualmente le immagini una per una ai valori max e min scelti. Di conseguenza, gli utenti non esperti e non ben addestrati non hanno la lettura corretta durante la sessione di acquisizione e potrebbero fuorviare i dati o perdere informazioni importanti in quel momento. Per questo, l’esperimento pilota è vantaggioso.
Una delle domande più comuni sulla progettazione dell’esperimento proof-of-concept è come scegliere la durata e la dose del trattamento. Per le nuove entità chimiche, questi parametri sono solitamente definiti dalla potenza e dalla selettività del composto in vitro, in combinazione con i dati generati dal metabolismo e dalla farmacocinetica dei farmaci (DMPK) e dagli studi di tollerabilità condotti prima dei test in vivo per l’efficacia. In sintesi, dopo aver identificato i composti in grado di uccidere selettivamente il parassita all’interno delle cellule, i primi esperimenti ADME (assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione) vengono eseguiti in vitro per stimare, tra gli altri parametri, la solubilità acquosa dei composti, la permeabilità cellulare e la stabilità metabolica. Se i composti mostrano un buon equilibrio di proprietà in vitro (solitamente definite nei profili dei candidati bersaglio), allora questi candidati vengono sottoposti a studi di farmacocinetica (PK) in vivo su topi sani, che delineano l’esposizione del composto nel sangue (e possibilmente anche nei tessuti) e forniscono un’idea generale della tollerabilità a diversi livelli di dose17, 34,43. Idealmente, l’obiettivo della valutazione farmacocinetica nella maggior parte delle malattie infettive è determinare la fattibilità di raggiungere concentrazioni plasmatiche libere (corrette per il legame con le proteine plasmatiche) che sono superiori alle concentrazioni EC50/EC90 44 – la concentrazione efficace che uccide o almeno inibisce la crescita del 50% o del 90% dei parassiti, rispettivamente – per un periodo di tempo sufficientemente lungo. Se si raggiunge un’esposizione sufficiente a un certo livello di dose, questo regime può essere utilizzato durante gli studi di efficacia utilizzando il modello Chagas BLI. Per gli studi di riposizionamento dei farmaci, devono essere disponibili dati farmacocinetici in vitro e in vivo. Un buon inizio per la riprofilazione dei farmaci sono i database chimici come PubChem45, che forniscono dati riconosciuti che possono essere convertiti in topi utilizzando la scala allometrica46 per stimare i regimi di trattamento sicuri e non tossici da testare. Tuttavia, non è sempre così. Gli studi sulla farmacocinetica sono ancora un campo trascurato nella scienza accademica e poche aziende farmaceutiche pubblicano i loro risultati sulla farmacocinetica. La comunità scientifica della scoperta di farmaci raccomanda di includere la valutazione farmacocinetica in vivo insieme ai saggi di efficacia dei farmaci (farmacodinamica)47. Pertanto, l’imaging preclinico è compatibile con le misurazioni dei composti contemporaneamente e questo approccio associato migliora la robustezza dei dati.
Inoltre, la manipolazione, il peso e le condizioni di salute dei topi vengono monitorati durante l’intero esperimento. I segni di tossicità e gli effetti collaterali come curvatura, tremore, perdita di equilibrio, riluttanza a muoversi, riluttanza a mangiare o bere, prostrazione o qualsiasi altra anomalia presente nel gruppo o nelle condizioni individuali del topo devono essere registrati e riportati negli studi preclinici. Uno degli obiettivi dell’imaging ottico è garantire il benessere degli animali. Pertanto, gli endpoint umani dovrebbero essere applicati nei topi con segni di dolore descritti nella scala48 della smorfia. Inoltre, i topi sono stati pesati settimanalmente durante l’acquisizione del BLI e, più spesso, durante il dosaggio del farmaco e il trattamento con CTX. Seguendo le normative sul benessere degli animali, i topi che perdono più del 20% del peso corporeo devono essere immediatamente soppressi in modo umano.
Il modello bioluminescente di T. cruzi è ora il modello sperimentale all’avanguardia per la scoperta e lo sviluppo di nuovi trattamenti per la malattia di Chagas. Un modello che replica le caratteristiche chiave dell’infezione da T. cruzi e della malattia di Chagas49, consentendo il monitoraggio in tempo reale della parassitemia e la differenziazione di composti con vari profili di efficacia associati a modalità d’azione note. Il BLI è una tecnica che migliora l’assertività nell’identificazione dei tessuti infetti. Consente la selezione precisa di tessuti infetti da utilizzare in un’ampia gamma di approcci, inclusi tutti i metodi classici già applicati nella ricerca su T. cruzi 50,51. Inoltre, consente ai ricercatori di esplorare tecnologie all’avanguardia e svilupparne di nuove33. Inoltre, BLI fornisce il miglioramento del benessere animale e un uso più razionale secondo i principi delle 3R10,35, tutto in una volta.
Diversi gruppi di ricerca incentrati sulle malattie tropicali neglette sono collocati in paesi in cui i dispositivi di imaging in vivo non sono disponibili. Per superare lo scenario attuale, nuove reti internazionali come Global BioImaging e i loro consorzi associati promuovono azioni per fornire un accesso aperto alle strutture di base dell’imaging e migliorare la formazione del personale e degli scienziati dell’imaging52,53. Queste iniziative, insieme a protocolli utente amichevoli come questo, possono offrire condizioni di democratizzazione delle tecnologie di fascia alta per tutti i ricercatori. L’implementazione di questo metodo nella scoperta preclinica di farmaci ha offerto una solida lettura dell’efficacia e un valore predittivo dell’esito clinico, facilitando la scoperta di farmaci per la malattia di Chagas.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano Amanda Franscisco, John Kelly e Fanny Escudié per aver fornito formazione e supporto sui test di efficacia dei farmaci, John Kelly e Simone Calderano per aver fornito i parassiti e Gabriel Padilla per il supporto con gli studi sugli animali. A.C.S ha ricevuto una borsa di studio CAPES PSDE per la formazione presso la London School of Hygiene and Tropical Medicine (Regno Unito). Gli autori desiderano inoltre ringraziare la piattaforma di ricerca sulla citometria a flusso e l’imaging (FLUIR) presso la Core Facility for Scientific Research – University of Sao Paulo (CEFAP-USP) per il supporto tecnico con l’analisi delle apparecchiature IVIS Spectrum e il Laboratorio di Genetica e Controllo Sanitario ICB-USP per i saggi post-sperimentazione per il controllo di qualità dei topi come privi di patogeni specifici. Questo progetto è stato finanziato da DNDi. DNDi è grata ai suoi donatori, pubblici e privati, che hanno fornito finanziamenti per tutte le attività di DNDi sin dal suo inizio nel 2003. Un elenco completo dei donatori di DNDi è disponibile all’indirizzo https://dndi.org/about/donors/.
BD LSRFortessa™ X-20 Cell Analyzer | BD Biosciences | ||
Weighing Balance (animal facility) | Available from several suppliers | ||
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Revvity (former PerkinElmer) | ||
FlowJ Software v10.7.1 | BD Biosciences | ||
Living Image Software for Spectrum v4.7.1 | Revvity (former PerkinElmer) | License Free Analysis Software called 'Aura Imaging' could be used for the most basic features provided by Spectral Instruments Imaging (Bruker company) (https://spectralinvivo.com/software/) | |
Microsoft Office software | Microsoft | ||
GraphPad Prism v8.4.0 | GraphPad Software Inc. | ||
DMEM Low Glucose | Vitrocell | D0025 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
Foetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Trypsin 0.5% EDTA | Gibco | 25300-062 | |
LIT medium | In house | ||
Hygromycin B (50 mg/mL) | Gibco | 10687010 | |
Grace′s Insect Medium | Sigma-Aldrich | G9771 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | |
IVISBrite d-luciferin potassium salt | Revvity (former PerkinElmer) | 122799 | Also could be used: VivoGlo Luciferin, in vivo grade (Promega/P1043); D-Luciferin, Monopotassium Salt (Thermo Scientific/88293) or PierceD-Luciferin, Monosodium* Salt (Thermo Scientific/88291); D-Luciferin, Potassium Salt (GoldBio/LUCK or eLUCK); D-Luciferin, Sodium* Salt (GoldBio/LUCNA or eLUCNA) *Sodium or potassium salt differences relies minimal chances on solubility, however do not affect in vivo performance. |
DPBS | Gibco | 21600-044 | |
Cyclophosphamide (CTX) | Sigma-Aldrich | C0768-5g | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879 | |
(Hydroxypropyl)methyl cellulose (HPMC) | Sigma-Aldrich | 09963-25G | |
Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | 402834 | |
Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754-1L | |
Benznidazole | ELEA | ||
Posaconazole (Noxafil commercial formulation) | Schering-Phough | ||
Giemsa | Available from several suppliers | ||
gavage needle (stainless-steel straight) – 22GA | Aton | CA2003 | |
1 mL Syringe and 31G needle | Available from several suppliers | ||
1 mL Syringe and removable 26G needle | Available from several suppliers | ||
1 mL Syringe and removable 24G X¾ needle | Available from several suppliers | ||
Sterile Syringe Filter 0.2 µm | Available from several suppliers | ||
A4 Matte Black paper 120gr or thicker | Paper Color/ Canson (Available from several suppliers) | ||
aluminum foil | Available from several suppliers | ||
Neubauer chamber | Available from several suppliers |
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