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면역학 및 감염병학

Desmistificando imagens de bioluminescência in vivo de um modelo de camundongo com doença de Chagas para estudos de eficácia de medicamentos

Published: May 31, 2024
doi:
10.3791/66740
, , , ,
1Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biomédicas (ICB),Universidade de São Paulo, 2Drugs for Neglected Diseases initiative (DNDi) Latin America, 3Programa de Pós-Graduação em Microbiologia e Imunologia,Universidade Federal de São Paulo, 4Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas,Universidade de São Paulo

Summary

O protocolo aqui fornecido descreve as etapas detalhadas para a realização de estudos de eficácia de medicamentos em um modelo bioluminescente da infecção por Trypanosoma cruzi , com foco na aquisição, análise e interpretação de dados. Procedimentos de solução de problemas e controle de qualidade para minimizar problemas técnicos também são fornecidos.

Abstract

Para controlar e diminuir o impacto na saúde pública de doenças de protozoários humanos, como doença de Chagas, leishmaniose e tripanossomíase humana africana, é necessário acelerar o desenvolvimento de novos medicamentos e vacinas. No entanto, esse processo está repleto de dificuldades, como biologia de parasitas altamente complexos e patogênese de doenças e, como típico de doenças tropicais negligenciadas, financiamento comparativamente limitado para pesquisa e desenvolvimento. Assim, modelos de estudo in vitro e in vivo que possam reproduzir suficientemente as principais características da infecção e da doença, ao mesmo tempo em que fornecem uso racional de recursos, são essenciais para o progresso da pesquisa para essas condições. Um exemplo é o modelo de camundongo de imagem de bioluminescência in vivo (BLI) para a doença de Chagas, que fornece detecção altamente sensível de luz de comprimento de onda longo gerada por parasitas Trypanosoma cruzi que expressam luciferase. Apesar dessa técnica se tornar a abordagem padrão para estudos de eficácia de medicamentos in vivo , os grupos de pesquisa ainda podem ter dificuldades para implementá-la devido à falta de treinamento prático adequado sobre manuseio de equipamentos e aplicação de procedimentos de controle de qualidade, mesmo quando o equipamento BLI adequado está prontamente disponível. Considerando esse cenário, este protocolo visa orientar desde o planejamento de experimentos até a aquisição e análise de dados, com detalhes que facilitem a implementação de protocolos em grupos de pesquisa com pouca ou nenhuma experiência com BLI, seja para doença de Chagas ou para outros modelos de camundongos infectologistas.

Introduction

A doença de Chagas é endêmica na América Latina e afeta aproximadamente sete milhões de pessoas em todo o mundo1. Anualmente, mais de 50.000 mortes e perdas econômicas de cerca de 7 bilhões de dólares resultam da natureza incapacitante dessa doença2. A doença de Chagas é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, um parasita hemoflagelado heteroxênico capaz de infectar mamíferos (silvestres e domésticos) e triatomíneos vetores (Hemiptera, Reduviidae)3 nas Américas, onde a transmissão vetorial é estabelecida. Outras vias importantes de infecção incluem transfusão de sangue, transplante de órgãos, transmissão oral (pela ingestão de alimentos contaminados com um triatomíneo infectado)4 e transmissão congênita. As vias de transmissão não vetoriais têm contribuído para a disseminação da doença de Chagas para áreas não endêmicas 3,5.

A doença de Chagas se manifesta em duas fases clínicas. A fase aguda é, na maioria dos casos, assintomática. As infecções sintomáticas geralmente estão associadas a sinais inespecíficos, como febre, fadiga, mialgia, linfadenopatia, esplenomegalia e hepatomegalia. A fase aguda também está frequentemente associada à parasitemia patente e à circulação sistêmica de parasitas. O óbito pode ocorrer em até 10% dos casos diagnosticados, principalmente nos de infecção oral6. A fase crônica é frequentemente caracterizada por um longo período de ausência de quaisquer sintomas. Com o tempo, aproximadamente um terço dos pacientes infectados décadas antes apresenta manifestações cardíacas, geralmente acompanhadas de fibrose e inflamação miocárdica, e/ou distúrbios gastrointestinais relacionados principalmente ao desenvolvimento de síndromes de megaesôfago e/ou megacólon 3,5,6.

O tratamento etiológico da doença de Chagas consiste em apenas duas drogas: benznidazol e nifurtimox. Esses agentes antiparasitários estão disponíveis há mais de 50 anos e têm toxicidade considerável e eficácia limitada 5,7,8. Consequentemente, há uma necessidade premente de desenvolver tratamentos novos, seguros e mais eficazes para pacientes com doença de Chagas.

Técnicas mais sofisticadas e precisas possibilitam agora a obtenção de respostas para velhas perguntas que permitem avanços na busca de novos tratamentos para a doença de Chagas. Nesse sentido, a comunidade científica se beneficia muito dos parasitas geneticamente modificados para estudos in vivo sobre o curso da infecção e avaliação da eficácia dos medicamentos 9,10,11,12. Um ensaio longitudinal baseado no sistema de imagem de bioluminescência (BLI) permite a avaliação da eficácia durante e após o esquema de tratamento, levando à identificação de compostos com atividade tripanocida10,13. O método BLI fornece uma medição direta da carga parasitária, tanto em circulação quanto em tecidos e órgãos, por meio da quantificação da luz produzida pela linhagem geneticamente modificada T. cruzi CL Brener Luc::Neon11, que expressa constitutivamente a luciferase do vaga-lume12.

No entanto, quase 10 anos após o estabelecimento do modelo animal BLI da doença de Chagas e estudos de eficácia de drogas, apenas alguns grupos de pesquisa dominam essa técnica. Esse fato se deve não apenas ao acesso reduzido a equipamentos de imagem adequados, mas também à falta de treinamento e disponibilidade de protocolos estruturados e detalhados. Este método apresenta várias vantagens em relação a outras abordagens, que dependem da avaliação da parasitemia por microscopia, sorologia ou avaliação de infecção de órgãos/tecidos por qPCR para detecção de DNA do parasita, pois permite melhorar o bem-estar de camundongos e reduzir o uso de animais pela possibilidade de geração de dados mais robustos e integrados in vivo. Além disso, esse método é, sem dúvida, mais sensível, pois permite a detecção imediata de focos parasitários em órgãos viscerais após o tratamentomedicamentoso 10,12. Portanto, este protocolo visa orientar os grupos de pesquisa em Parasitologia e outras doenças infecciosas a estabelecerem essa metodologia em seus laboratórios, detalhando os procedimentos técnicos. Aqui, compartilhamos a experiência obtida com a implementação do modelo BLI da doença de Chagas no Brasil, o primeiro do gênero na América Latina, como parte dos esforços de descoberta de medicamentos coordenados pela iniciativa Medicamentos para Doenças Negligenciadas (DNDi).

Protocol

Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram submetidos, aprovados e conduzidos de acordo com as diretrizes14 preconizadas pelo Comitê de Ética Animal do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo: protocolo CEUA ICB/USP no 5787250522. 1. Soluções NOTA: Considere o volume administrado preconizado de 10 mL / kg (200 μL para um peso de 20 g de camundongo) 15 , 16 . Por exemplo, prepare uma solução de trabalho de 15 mg/mL para atingir 150 mg/kg de dosagem animal. Veículo suspenso de hidroxipropilmetilcelulose (HPMC-SV)NOTA: Os reagentes necessários são 0.5% (p / v) de hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), 0.4% (v / v) Tween 80 e 0.5% (v / v) de álcool benzílico.Para 200 mL de solução veicular, pesar 1 g de HPMC e dissolver em 64 mL de água quente ultrapura. Mexa por 2 min. Adicione 120 mL de água ultrapura gelada e mexa por 1 h. Adicione 1 mL de álcool benzílico. Em seguida, adicione 0,8 mL de Tween 80 usando a técnica de pipetagem reversa e continue mexendo até que a solução fique transparente. Ajustar a solução para o volume final de 200 ml. Armazene o HPMC-SV sob refrigeração (4 °C) por no máximo 3 meses. BenznidazolCalcular a quantidade necessária de solução composta do seguinte modo:Volume de solução composta = (número de doses em cada dia x número de dias x número de camundongos a serem tratados x volume administrado em cada camundongo) + 30% extra. Pese a quantidade necessária de benznidazol (BZ), considerando a dose desejada. Para o tratamento curativo, uma dose oral de 100 mg/kg uma vez ao dia por 10 dias atinge 100% de cura no modelo de DC crônica17. Considerando o volume final desejado, calcule a quantidade adequada para atingir uma concentração de 5% (v/v) de DMSO e dissolva completamente o BZ em DMSO puro. Adicione o volume adequado do veículo a um tubo de vidro para atingir uma concentração de 95% (v/v) HPMC-SV. Transfira o BZ dissolvido em DMSO para o tubo de vidro contendo HPMC-SV. Homogeneizar vigorosamente a suspensão e armazená-la a 4 °C.Por exemplo: Volume final da formulação BZ = 10 mL (etapa 1.2.1)Quantidade de BZ = 100 mg (etapa 1.2.2)5% DMSO = 0,5 mL (etapa 1.2.3) e 95% HPMC-SV = 9,5 mL (etapa 1.2.4) Antes de cada administração do medicamento, as formulações são colocadas em banho-maria ultrassônico por 5 min a 37 °C e vigorosamente homogeneizadas antes da dosagem do animal. CiclofosfamidaDissolva a quantidade necessária de ciclofosfamida em água ultrapura para obter uma solução de 12,5 mg / mL. Esterilizar a solução por filtração e conservar a 4 °C. Mancha de GiemsaDissolva 0,6 mg de reagente em pó Giemsa em 50 mL de metanol. Adicione 25 mL de glicerol e misture. Remova os precipitados usando papel de filtro e um funil. Conservar a solução-mãe à temperatura ambiente (RT), protegida da luz. Prepare uma solução de trabalho diluindo 10 mL de solução Giemsa em 90 mL de tampão fosfato misto (20,5 M Na2HPO4, 65,4 M KH2PO4 a pH 7,2). 2. Cultura de Trypanosoma cruzi Trabalhando em uma cabine de segurança biológica (BSC), cultivar 4 x 106 epimastigotas/mL de T. cruzi CL Brener Luc::Neon11 em meio LIT (68,44 mM NaCl, 5,36 mM KCl, 112,7 mM Na2HPO4, 5 g/L triptona, 5 g/L de caldo de infusão de fígado, 0,03 M de hemina, 4,16 mM de glicose), suplementado com 10% (v/v) de Soro Fetal Bovino (FBS), 100 μg/mL de penicilina, 100 U/mL de estreptomicina e 150 μg/mL de higromicina como fármaco seletivo a 28 °C. Os parasitas normalmente atingem uma fase estacionária em 3-4 dias. Induzir a metaciclogênese para obter parasitas infecciosos incubando 3 x 108 epimastigotas em 10 mL de meio Grace’s Insect com 10% (v / v) de FBS em tubos cônicos de 15 mL a 28 ° C por 7 a 10 dias. Avalie a taxa de diferenciação por esfregaços de coloração de Giemsa. Para isso, espalhe 20 μL dos parasitas diferenciados em uma lâmina de vidro e deixe secar por 10 min. Em uma capela de exaustão, proceda com a fixação da amostra cobrindo a lâmina de vidro com metanol puro e deixe secar completamente (1-2 min). Cubra a lâmina de vidro com a solução de trabalho Giemsa por 20 min. Lave suavemente a lâmina de vidro com água destilada. Em um microscópio, conte a porcentagem de tripomastigotas metacíclicos. Se uma taxa de diferenciação de pelo menos 10% for alcançada, prossiga para a próxima etapa. Centrifugue os parasitas (120 x g por 10 min) e ressuspenda o pellet com 10 mL de DPBS. Centrifugue mais uma vez e ressuspenda os parasitas em 5 mL de DMEM suplementado com 10% (v / v) de FBS, 100 μg / mL de penicilina e 100 U / mL de estreptomicina. Em um frasco de cultura de 25 cm2 , realizar a infecção de células 1,66 x 105 LLC-MK2 (células epiteliais renais de Macaca mulatta) a 37 °C em CO5% 2, em incubadora umidificada18. Os tripomastigotas de cultura de tecidos (TCTs) são liberados no meio após 8-9 dias. Infecte monocamadas de células LLC-MK2 frescas com TCTs em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1:40. 3. Análise da homogeneidade populacional de Trypanosoma cruzi por citômetro de fluxo Colete TCTs de cepas de tipo selvagem CL Brener Luc::Neon e CL Brener, centrifugue a 120 x g por 10 min e ressuspenda os TCTs em DPBS. Ajuste a densidade do parasita para atingir 1 x 106 / mL. Prossiga com a análise populacional por citômetro de fluxo baseado em fluorescência mNeonGreen (ex. 506 / em. 517 nm) 19, adquirindo pelo menos 20.000 eventos para cada amostra.NOTA: A porcentagem da população fluorescente é obtida comparando o tipo selvagem com o parasita transfectado. Para prosseguir com a infecção de camundongos, um mínimo de 95% da população de parasitas fluorescentes da linhagem CL Brener Luc::Neon deve ser alcançada (Figura Suplementar 1). 4. Infecção experimental de camundongos NOTA: Para aumentar a quantidade de parasitas, tripomastigotas da corrente sanguínea (BT) são freqüentemente obtidos de camundongos imunodeficientes10,13. Aqui, a imunossupressão química de camundongos BALB/C é usada para obter TB. Para isso, a imunossupressão leve é alcançada com quatro injeções intraperitoneais de ciclofosfamida (CTX) a 62,5 mg/kg com intervalos de 96 h, que é realizada concomitantemente à infecção pelo T. cruzi. Administrar 62,5 mg/kg de ciclofosfamida estéril por injeção intraperitoneal (i.p.) 1 dia antes da infecção pelo T. cruzi . Infecte cada camundongo com 1 x 104 TCTs em 0,2 mL de DPBS por via intraperitoneal. Atenção ao alto risco de incidentes no manuseio de patógenos e agulhas. Realize a infecção em um BSC, usando luvas e protetor facial durante todo o procedimento. Monitore a parasitemia diariamente por meio da observação direta da TB no sangue (método de Pizzi-Brener)20. No pico da parasitemia, em torno de 13-17 dias pós-infecção (dpi), realizar a coleta de sangue. Para isso, anestesiar camundongos com 100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina. Quando os camundongos estiverem completamente anestesiados21, proceda à punção cardíaca com uma seringa de 1 mL acoplada a uma agulha 24 G X3/4 contendo 50 μL de citrato de sódio a 3,8% (p/v). Desconecte a agulha e coloque suavemente o sangue em um tubo de centrífuga. Em um BSC, execute uma diluição de uma alíquota de sangue em tampão de lise de cloreto de amônio-potássio (ACK) e conte os parasitas na câmara de Neubauer. Repita este procedimento pelo menos duas vezes, pois pequenos coágulos sanguíneos influenciam a contagem de parasitas.NOTA: Para evitar erros de contagem, ajustar o factor de diluição para evitar contagens inferiores a 30 e superiores a 300 tripomastigotas na câmara de Neubauer. Ajuste a densidade do parasita para 5 x 103 BT / mL misturando a quantidade necessária de sangue puro na DPBS. Infectar camundongos BALB/c não imunossuprimidos com 1 x 103 BT em 0,2 mL de DPBS por camundongo (5 x 103 BT/mL) por via intraperitoneal usando uma agulha 26 G (agulhas mais estreitas levam à lise do parasita)22. Depois de injetar o volume por via intraperitoneal, segure a agulha dentro do mouse por 5 s para evitar refluxo. Coloque os camundongos infectados temporariamente em uma caixa com uma toalha de papel para identificar possíveis vazamentos ou sangramentos e, em seguida, devolva os camundongos às gaiolas. 5. Imagem in vivo NOTA: O glossário dos termos usados aqui é o seguinte: Sessão de imagem: Aquisição de bioluminescência realizada em todos os grupos de um determinado experimento em um determinado dia. A Figura 1A mostra uma visão geral do procedimento. Rodada de imagem: Procedimento realizado em subgrupos de três camundongos, desde a injeção de D-luciferina até a recuperação anestésica. Recomenda-se que cada grupo experimental contenha 6 camundongos, devido à variabilidade intrínseca da carga parasitária dos camundongos e outros fatores que influenciam a quantificação do BLI descritos abaixo. Aquisição de imagens: Sessão fotográfica realizada pelo equipamento de imagem para quantificar a bioluminescência, o que resulta em uma sobreposição de imagem de uma fotografia e na bioluminescência quantificada mostrada como uma escala de pseudocor. Procedimento de imagem: Todas as etapas discutidas nesta sessão do protocolo. Figura 1: Aquisição de dados do BLI. (A) Diagrama do fluxo de trabalho de aquisição aplicado para estudos de doenças infecciosas, usando o modelo de camundongo bioluminescente da doença de Chagas como exemplo. Camundongos infectados com T. cruzi geneticamente modificado são analisados por imagens in vivo nos momentos estabelecidos. Em cada rodada de imagem, grupos de até três camundongos são injetados com 150 mg / kg de substrato enzimático (D-luciferina). Após 5 min, a anestesia é administrada a 2,5% (v/v) de isoflurano em oxigênio. Quando completamente imóveis, os camundongos são colocados em um sistema de imagem e a aquisição é iniciada seguindo as configurações definidas. Após a imagem, os camundongos se recuperam da anestesia e são devolvidos às gaiolas. Perguntas e problemas frequentes que os pesquisadores podem ter e enfrentar durante a aquisição são destacados em vermelho. Este esquema foi modificado a partir de Lewis et al. (2014)12 (criado com BioRender.com: UD26KWEVS2). (B) Cinética in vivo da D-luciferina / luciferase do vaga-lume com desvio para o vermelho (PpyRE9h). Camundongos no pico de parasitemia do T. cruzi (n = 3) foram anestesiados e injetados com 150 mg/kg de D-luciferina. As imagens foram adquiridas por 1 h (tempo de exposição: 2 min; binning: 4). Acima: quantificação do fluxo total ventral (p/s) (eixo Y esquerdo, em vermelho) e como porcentagem da medida média mais alta (eixo Y direito, em azul). Os dados são mostrados como média (curvas) e desvio padrão (área sombreada). Inferior: Imagens adquiridas do primeiro (4 min), sinal BLI mais alto (30 min) e último (62 min) pontos de tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Verifique a barra verde na janela Aquisição para verificar se a câmera do dispositivo de carga acoplada (CCD) está fria (-90 °C). Clique na barra (verde ou vermelha) para visualizar a temperatura.NOTA: De acordo com o manual do equipamento de imagem, o equipamento e o software de imagem devem estar ligados o tempo todo para manter o CCD frio. Verifique se o ajuste automático do plano de fundo foi executado. Para fazer isso, clique em Aquisição > Plano de fundo > Exibir Dark Charge disponível. Uma lista com várias combinações de configurações aparecerá.NOTA: Este procedimento reduz o ruído de luminescência. Se a configuração escolhida resultar em um valor superior a 1000, com base na fórmula “tempo de exposição x (binning²)”, a carga escura não deve ser ignorada. Dependendo das configurações do software, a compartimentalização pode ser mostrada como um número (fator de compartimentalização) ou um intervalo de ‘pequeno’ a ‘grande’. A correspondência entre o intervalo e o fator de binning pode ser encontrada no manual do dispositivo. Se a Janela de Atividade (área branca na parte inferior do software) não for exibida, ative-a na Exibição de Menu > na Janela de Atividade. Defina a área de imagem clicando em Janela de aquisição > Campo de visão. A opção C (13,2 cm) adquire 3 camundongos e a opção D (22 cm) adquire 5 camundongos. Selecione a opção de salvamento automático clicando em Aquisição > Salvamento automático e selecione ou crie uma nova pasta para cada ponto de tempo. Coloque um papel preto fosco na área de imagem e coloque as lâminas de partição perpendicularmente entre as entradas. Se o fabricante não forneceu as lâminas, use pedaços (3 cm x 15 cm) de papel preto fosco. Ajuste a área interna da câmara de imagem para acomodar os cones do nariz de vidro às entradas de anestesia. Use pequenos pedaços de fita isolante preta para prender o sistema de anestesia à plataforma (fora da área da imagem).NOTA: Em algumas versões de dispositivos de imagem, um laser define a área de imagem. Se esta ferramenta não estiver disponível, adquira imagens através do software para verificar os slides de particionamento dentro da área de imagem. Defina o vaporizador de isoflurano para 2.5% (v/v) em oxigênio para as câmaras de imagem e indução. Verifique pelo manômetro se o gás está fluindo através do sistema21.NOTA: Se o dispositivo de imagem não tiver um sistema de anestesia inalatória acoplado a ele, outras opções de anestesia são possíveis, como xilazina e cetamina injetáveis23. Nesse caso, a recuperação dos camundongos é lenta e o risco de morte é alto24. Encha as seringas (agulhas de 31 G) com D-luciferina (um protocolo abrangente para preparar a D-luciferina é fornecido por diferentes fornecedores)25,26, proteja-as da luz direta e prepare alguns recipientes de plástico ou gaiolas extras cobrindo o interior com uma toalha de papel. Mantenha um relógio por perto para rastrear facilmente o tempo e um caderno de laboratório para registrar grupos de camundongos, tempo de injeção de luciferina e qualquer outra informação durante o procedimento. Pese todos os ratos e registre seu peso. Marque cada rato com um marcador de caneta ou tatuagem na cauda. Mantenha a identificação dos ratos bem exibida durante todo o experimento. Esta etapa também pode ser realizada no dia anterior à aquisição.NOTA: A marca não deve ocupar uma grande área do corpo, pois a tinta pode interferir no sinal bioluminescente. Marcadores permanentes de cores diferentes também podem ajudar a diferenciar os grupos. Para iniciar a sessão de Imagem, registe uma imagem luminescente de fundo (definições: Tempo de Exposição: 5 min; Binning: ‘grande’ ou ’16’, f/stop: 1) da câmara de imagem sem camundongos. Este procedimento ajuda a identificar fontes de luz luminescentes automáticas ou problemas indesejados no equipamento.NOTA: Como o BLI é baseado na reação enzimática, o tempo é uma característica essencial do experimento. Verifique todos os itens listados acima e as configurações do equipamento antes de iniciar o manejo do animal. Injete 150 mg / kg (i.p.) de D-luciferina nos primeiros 3 camundongos sem atingir os órgãos internos. Coloque os camundongos na caixa do recipiente para avaliar se a D-luciferina vaza (solução amarela brilhante). Anote se isso acontecer e registre o grupo de camundongos e o tempo de injeção de D-luciferina. Aguarde 5 minutos e transfira os camundongos para a câmara de indução anestésica. Ligue o sistema. Demora cerca de 3 minutos para os ratos serem totalmente anestesiados (ausência de respostas como pernas tremendo, cauda, etc.) 21. Abra a porta do dispositivo de imagem, ligue o fluxo anestésico para a câmara de imagem e, ao mesmo tempo, desligue a câmara de indução. Coloque cada mouse na posição dos cones do nariz: do mouse 1-3, da esquerda para a direita. Acomode suavemente os camundongos com o lado ventral para cima dentro da área de imagem mostrada pelo laser. Durante a acomodação, verifique a identificação e a posição dos ratos. Não force a entrada de camundongos parcialmente anestesiados em cones nasais. Coloque as lâminas de partição entre os mouses e feche a porta do equipamento de imagem. Ajuste as configurações de aquisição na janela Aquisição de software, da seguinte maneira:Para camundongos não infectados, Tempo de exposição = 5 min / Binning = ‘grande’ ou ’16′(conjunto de configurações matematicamente sensível para definir os valores limite). Para camundongos infectados no modelo agudo: Tempo de exposição = 2 min / Binning = ‘médio’ ou ‘4’. Para camundongos infectados no modelo crônico: Tempo de exposição = 5 min/ Binning = ‘grande’ ou ’16’. Verifique se o tempo de injeção de D-luciferina foi realizado pelo menos 10 min antes de iniciar a aquisição. Caso contrário, aguarde o período necessário para obter as imagens durante o pico do sinal da luciferase (Figura 1B); caso contrário, clique em Adquirir para iniciar a aquisição de imagens. A janela Rótulos de imagem aparecerá após o início da imagem. Preencha as caixas com as informações apropriadas sobre cada grupo, incluindo tempo de injeção de luciferina, experimento, identificação de camundongos, ponto de tempo e qualquer outra informação desejada que possa ajudar a manter o registro. Essas informações serão incluídas no arquivo da tabela de medidas. Verifique se o sinal de aviso Imagem saturada é mostrado no final da aquisição da imagem. Imagens saturadas não são aceitáveis. Se isso acontecer, diminua o compartimentalização e adquira uma nova imagem. Faça anotações a serem consideradas na análise. Assim que a imagem for adquirida, abra a porta da máquina de imagem e vire os mouses para a vista dorsal (com a parte de trás para cima). Execute a aquisição novamente e rotule-a adequadamente. Ao final dessa aquisição de imagem, desligue o fluxo anestésico. Remova cuidadosamente os camundongos da câmara de imagem e coloque-os em um recipiente. Registre o peso corporal dos camundongos enquanto observa a recuperação da anestesia. Registre qualquer comportamento anormal ou anormalidades corporais encontradas durante o procedimento. Assim que os ratos voltarem a se mover, coloque-os em suas gaiolas.NOTA: Verifique a intensidade do BLI para cada imagem adquirida. Após o término da aquisição, a imagem bioluminescente gravada e a fotografia serão exibidas no software com uma escala automática que não deve ser considerada. Defina a escala definida na análise de dados (descrita abaixo) na janela Paleta de Ferramentas . 6. Análise dos dados NOTA: O protocolo acima é baseado em software comercial de imagem in vivo . No entanto, uma versão sem licença de software pode realizar a análise mais básica. Os detalhes do software podem ser encontrados na Tabela de Materiais. Abra arquivos.Abra a pasta que contém os dados adquiridos de um determinado ponto de tempo de geração de imagens selecionando Menu File > Browser > Selecione a pasta (Figura 2A – Etapa 1).NOTA: Uma nova janela será aberta em formato de tabela com todos os dados adquiridos salvos no arquivo escolhido. Ele exibirá o sinal do Número de Clique , que é o ID da imagem fornecido automaticamente pelo software (números de dados e horas), as informações fornecidas pelo pesquisador na janela Rótulos de Imagem durante a aquisição e as configurações de aquisição. Todos esses dados ajudam a classificar as imagens que podem ser usadas na análise, uma vez que imagens saturadas não devem ser usadas. Selecione várias linhas relacionadas às imagens escolhidas, incluindo os controles não infectados. Anote o ID da imagem no caderno do laboratório junto com as informações registradas durante a sessão de imagem. Monte as imagens selecionadas clicando em Carregar como grupo. Este procedimento cria uma nova imagem de sequência. Portanto, é possível ajustar os recursos para todas as imagens simultaneamente. Salve a nova imagem de sequência em uma nova pasta diferente daquela usada na etapa 6.1 para facilitar a reanálise de dados brutos, se necessário. Na imagem de sequência, identifique o binning usado para cada imagem clicando em Opções > Exibir > Selecionar Fator de Binning (Figura 2A – Etapa 2). O fator de compartimentalização adquirido será exibido na parte superior de cada imagem na sequência. Corrija todos os fatores de compartimentalização para o mesmo número. Para isso, clique duas vezes na imagem a ser ajustada. Na janela Paleta de ferramentas > seção Ajuste de imagem , escolha o fator de compartimentalização apropriado (Figura 2A – Etapa 3) – consulte a etapa 5.18 para a escolha do fator de compartimentalização. Execute este procedimento em todas as imagens divergentes.NOTA: Este procedimento influencia diretamente a quantificação do IVM (Tabela 1) e é abordado mais detalhadamente na seção Discussão. Defina a escala.Distinguir sinal bioluminescente válido (acima de 600 contagens de acordo com o manual do dispositivo) com base no controle não infectado. Para isso, clique duas vezes na imagem dos camundongos não infectados. Em seguida, no canto superior esquerdo da nova janela, selecione a opção Contagens no campo Unidades . Em seguida, ajuste a Escala de cores para o valor mínimo de 600. A imagem resultante será a linha de base para definir a escala mínima em radiância. Com a janela de sequência ativa, selecione a opção Radiância no campo Unidades . Ajuste a escala de cores e a tabela de cores na paleta de ferramentas. Para isso, desative a caixa Individual na área Limites da escala de cores . Marque as caixas Escala Logarítmica e Manual (Figura 2A – Passo 4). Defina os números mínimos da escala de acordo com o controle não infectado (conforme observado na etapa 6.8) e a área com o sinal mais alto como o máximo (conforme mostrado na Figura 2A pelas setas).NOTA: O monitoramento de luz 2D in vivo é uma quantificação relativa. Diferentes valores de escala podem ser encontrados devido a diferenças na versão e calibração de cada dispositivo. Portanto, os valores demonstrados nos resultados representativos não poderiam se encaixar em outros experimentos realizados em outros dispositivos e ainda assim ser igualmente válidos de acordo com os controles internos (não infectados e não infectados não tratados). Depois de definir a mesma escala para todas as imagens, clique duas vezes em cada imagem, maximize a janela e exporte a visualização da imagem em um formato de imagem (.jpg, .tiff, etc.) usando o botão Exportar gráficos , nomeando os arquivos por treatment_miceID_time ponto. (Figura 2A – Etapa 5). Execute este procedimento para todas as imagens. Realize medições.Escolha qualquer imagem da sequência e clique duas vezes nela. Na janela Paleta de ferramentas > na seção de ferramentas ROI , clique no botão Quadrado (Figura 2B – Etapa 1) e desenhe um retângulo cobrindo todo o mouse. Clique na borda do ROI criado e copie e cole o mesmo ROI para cada mouse (resultando em três ROIs na imagem). Salve os ROIs clicando em salvar na seção Ferramentas de ROI. Aplique os ROIs salvos para todas as imagens selecionando a caixa Aplicar à sequênciae clique em Carregar. Os ROIs salvos serão usados para todos os mouses em todo o experimento. Ajuste a posição do ROI em cada mouse para se adequar melhor ao animal na área de medição. Quando todos os mouses estiverem rotulados, clique no botão Medir ROIs (Figura 2B- Etapa 2). A Tabela de Medições de ROI será exibida. Selecione os tipos de medição: Radiância; Atributos de imagem: todos os valores possíveis; Dimensões do ROI: cm. Em seguida, clique no botão Selecionar tudo , seguido do botão Copiar . Cole os dados diretamente em um software de análise de tabela (planilha). Como alternativa, exporte um arquivo no formato .csv ou .txt. Trabalhe nos dados.No software de análise de tabelas, organize os dados por grupos (tratamento, controle não infectado, não tratado, etc.). A carga parasitária é mostrada como bioluminescência de corpo inteiro. Portanto, organize os dados para corresponder aos valores de fluxo total ventral e dorsal dos mesmos camundongos e some-os. Calcule a média e o desvio padrão dos valores somados considerando cada grupo (ex.: Tabela Suplementar 1). Plote os dados em software gráfico e estatístico. Prepare um painel com imagens bioluminescentes em um software de apresentação de imagens ou slides. Coloque cada mouse em uma coluna e cada ponto de tempo na linha para construir uma matriz de eficácia do medicamento para facilitar a visualização e interpretação dos dados.NOTA: Existe uma opção para criar as imagens diretamente no software de imagem sem executar a etapa 6.2.4 (Exibir > janela de layout de imagem). No entanto, a interface e as ferramentas do software limitam a organização dos dados. Figura 2: Etapas de análise de dados desde a configuração das escalas de imagem até a quantificação da luminescência. (A) Visualização do software de imagem viva para processamento de dados de imagem. Passo 1: Carregue os dados adquiridos como uma sequência usando a ferramenta Navegador. Etapa 2: identifique o binning usado para cada aquisição (aparecerá na parte superior das imagens individuais). Etapa 3: Defina todas as imagens de camundongos infectados com o mesmo fator de binning e aplique o fator de binning 16 para os camundongos não infectados. Passo 4: Defina a escala de cores manualmente com base em camundongos não infectados (seta roxa), que deve ser visto na tela como não bioluminescente, e camundongos infectados e não tratados nos focos bioluminescentes mais altos (seta vermelha), que devem ser vistos como vermelho. Passo 5: Para obter uma imagem livre de qualquer informação escrita, clique duas vezes em cada imagem e exporte a imagem usando o botão Exportar gráficos . (b) Visualização das ferramentas de regiões de interesse (ROI). Passo 1: Desenhe um ROI cobrindo inteiramente um rato e copie e cole o mesmo ROI para cada animal. Salve os ROIs ajustados e aplique-os a todas as imagens do experimento. Passo 2: Clique no botão Medir ROIs para gerar a tabela a ser exportada como .csv ou .txt. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 7. Procedimento ex vivo Injetar 150 mg/kg de D-luciferina i.p. no ratinho (um por ronda ex vivo ) e aguardar 3 min. Anestesiar os camundongos com 100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina i.p. Em um gabinete de segurança biológica, quando o camundongo não responde completamente ao beliscão das patas, corte a pele do camundongo para expor o peritônio (sem abrir a cavidade do peritônio) e o tecido da axila do lado esquerdo. Prossiga com a exsanguinação cortando a artéria e o vaso axilar. Colete o sangue usando uma pipeta Pasteur descartável. Em seguida, perfunda 10 mL de 0,3 mg / mL de D-luciferina em solução de DPBS através do ventrículo esquerdo do coração. Disponha os órgãos selecionados em pontos pré-estabelecidos em uma placa de Petri e mergulhe-os em solução de d-luciferina a 0,3 mg / mL. Este procedimento deve ser realizado dentro de 30 minutos no máximo. Adquirir a imagem luminescente dos órgãos excisados (coração, pulmões, timo, fígado, músculo quadríceps, mesentério, baço, rim, glândula adrenal, gordura visceral, esôfago, estômago, intestino delgado, ceco, cólon, cérebro, gordura subcutânea, útero, gordura gonadal, bexiga e membrana do peritônio) usando 5 min de tempo de exposição e binning 16, dependendo da intensidade do sinal (imagens saturadas não são aceitáveis)22.NOTA: O mesmo procedimento deve ser realizado em um camundongo não infectado antes dos infectados para definir o limite.

Representative Results

Usando um modelo de camundongo adequado baseado em parasitas transgênicos que expressam constitutivamente a luciferase, é possível reproduzir as principais características da infecção humana por T. cruzi causando danos mínimos ao hospedeiro, permitindo o rastreamento em tempo real dos parasitas por BLI de corpo inteiro do hospedeiro de forma longitudinal (ao longo da vida), por até vários meses12. A Figura 3 mostra um experimento piloto demonstrando o curso do tempo de infecção por CL Brener Luc::Neon desde o dia 1 pós-infecção até 150 dpi em camundongos BALB/c. Nos primeiros 20 dpi, a carga parasitária inferida pela bioluminescência aumenta, típica do pico de parasitemia, seguida por uma diminuição acentuada na carga parasitária, devido ao controle imunológico dos camundongos. Assim, a fase aguda da infecção é considerada os primeiros 50 dpi. A fase crônica é definida quando a infecção atinge uma taxa bioluminescente constante, de 100-150 dpi. Figura 3: Entendendo o modelo. Cinética da infecção por Trypanosoma cruzi CL Brener Luc::Neon em camundongos BALB/c (n = 11). Painel superior: imagens bioluminescentes ventrais e dorsais de diferentes momentos por 150 dias pós-infecção (dpi) com tripomastigotas 1 x 10³ da corrente sanguínea por injeção intraperitoneal. Escala do mapa de calor (em Log10) do sinal bioluminescente em radiância (p / s / cm2 / sr). Código de cores: Roxo = 5 x 103; vermelho = 1 x 107. Painel inferior: quantificação do sinal bioluminescente em Fluxo Total (p/s) de camundongos de corpo inteiro. Os dados são expressos como médias (linhas) e desvios padrão (regiões sombreadas). Os períodos definidos para as fases aguda e crônica da infecção neste modelo de camundongo são destacados em laranja. Os valores médios de luminescência de camundongos não infectados (n = 3) são mostrados como o limite (linha cinza claro). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Os resultados terapêuticos também podem ser previstos, uma vez que as principais fases da infecção são bem reproduzidas em um modelo de camundongo. Assim, o BLI agora é aplicado à ciência translacional por meio de estudos de prova de conceito que apoiam a tomada de decisão sobre o potencial de eficácia do composto e a progressão no pipeline de desenvolvimento10,27. No modelo agudo de camundongo, o tratamento oral deve ser iniciado quando a infecção atinge o pico de parasitemia (em torno de 14-21 dpi), caracterizado por um número elevado de tripomastigotas na corrente sanguínea (aproximadamente 1 x 105 tripomastigotas/mL – dados não mostrados) e infecção sistêmica. Na fase crônica, o tratamento com camundongos inicia-se em 100 dpi, quando a carga parasitária é comparativamente muito menor, com parasitemia subpatente estável. Para demonstrar a aplicação do protocolo descrito acima na avaliação de agentes antiparasitários, comparamos a eficácia do tratamento do benznidazol (BZ), droga padrão utilizada para o tratamento da doença de Chagas, e do posaconazol (Posa), um inibidor da esterol 14α-desmetilase (CYP51) que falhou em ensaios clínicos para doença de Chagas, e que também se mostrou ineficaz como agente antiparasitário contra o T. cruzi in vitro e in vivo, inclusive no modelo BLI descrito neste protocolo 13,18,28,29,30. Para o modelo de camundongo agudo, coortes de 6 camundongos por grupo foram tratadas por via oral por gavagem31 por 20 dias com Posa a 20 mg / kg ou BZ a 100 mg / kg, uma vez ao dia. Os camundongos também foram tratados com BZ por 5 dias a 100 mg / kg uma vez ao dia para avaliar o efeito de tratamentos curtos. Após a eliminação do composto (10 dias após o término do tratamento), os camundongos negativos para BLI foram imunossuprimidos, condição que promove recidiva da infecção quando a cura parasitológica não é alcançada (Figura 4A). O tratamento com Posa resultou em uma redução de 99,49% ± 0,27% (média ± desvio padrão) na carga parasitária inferida por bioluminescência no final do tratamento e permaneceu em níveis semelhantes de camundongos não infectados durante o período de eliminação do composto da droga (exceto para o camundongo # 3, com um sinal transitório a 40 dpi, e o camundongo # 2, que demonstrou um ponto fraco de BLI a 44 dpi). Em comparação com o grupo não tratado, o tratamento com BZ por 20 dias reduziu em 100% ± 0,01% a carga parasitária inferida pela bioluminescência ao final do tratamento. Em contraste, o tratamento curto com BZ por 5 dias levou a uma redução de 99,98% ± 0,03% a 19 dpi (semelhante ao nível limiar). No entanto, neste caso, a redução do BLI foi transitória e, nas aquisições subsequentes, todos os camundongos apresentaram reativação da infecção (Figura 4B). Figura 4: Desenho de experimento de prova de conceito e resultados obtidos com imagens de bioluminescência no modelo agudo da doença de Chagas. (A) Gráfico esquemático do processo de linha do tempo no modelo de camundongo com doença de Chagas aguda para estudos pré-clínicos para avaliação da eficácia do composto. Pontos pretos: pontos de tempo de imagem. Frasco de remédio e barra laranja: início e fim do tratamento, respectivamente. Ícone da seringa: injeções de ciclofosfamida. DPI: dia pós-infecção. Código de cores: cinza = infecção não tratada; laranja = período de tratamento; azul = fase de eliminação do composto; amarelo = período de imunossupressão. (B) Curso de tempo de tratamento de Trypanosoma cruzi. Painel esquerdo: imagens de bioluminescência ventral de camundongos BALB/c (i) não tratados ou tratados por 20 dias com (ii) posaconazol (Posa) a 20 mg/kg, (iii) benznidazol (BZ) a 100 mg/kg tratados por 20 dias e (iv) BZ a 100 mg/kg tratados por 5 dias com (n = 6/grupo). Todos os tratamentos foram administrados por via oral por gavagem (10 mL/kg) uma vez ao dia. O mapa de calor da escala Log10 indica a intensidade do sinal bioluminescente de baixo nível (azul) a alto (vermelho). Gráfico à direita: quantificação de corpo inteiro dos dados de imagem de bioluminescência. Os dados são expressos como médias (linhas) e desvios padrão (regiões sombreadas). Legenda: Frasco de medicamento: início do tratamento (14 dpi); barra laranja: final do tratamento (18 dpi/33 dpi); injeções de ciclofosfamida com ícone de seringa (do dia 44-53); ponto laranja: camundongo analisado pelo procedimento ex vivo ; § dados excluídos devido a vazamento de D-luciferina na urina. (C) Procedimento ex vivo para detecção de focos de T. cruzi em órgãos e tecidos. A chave de distribuição da placa é apresentada na parte inferior da figura (criada com BioRender.com: ZY26LG8AOF). Mesma escala de radiância mostrada no painel vivo . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Nesse modelo, o tratamento antiparasitário pode reduzir a carga parasitária abaixo do limite de detecção do BLI de 1000 parasitas. Assim, os camundongos aparecem como BLI negativo10. Para garantir que a cura parasitológica tenha sido alcançada, é necessário promover a imunossupressão de camundongos usando o tratamento com ciclofosfamida29,32. Camundongos que ainda têm uma carga parasitária indetectável após o tratamento medicamentoso se tornarão positivos para BLI após imunossupressão. Esse efeito é demonstrado mais extensivamente pelo tratamento com Posa no modelo agudo, que promove a recidiva do parasita. Neste experimento, o procedimento ex vivo foi realizado em camundongos com o menor sinal bioluminescente para avaliar o tropismo do tecido parasitário (Figura 4C). Camundongos não tratados mostram fortes sinais bioluminescentes, especialmente no trato gastrointestinal (TGI) e tecidos associados, como gordura visceral e mesentério. Além disso, a pele foi um local associado à persistência do parasito. Os camundongos tratados com Posa apresentaram manchas bioluminescentes de menor intensidade e mais restritas ao cólon, mesentério e gordura visceral. Por outro lado, em camundongos tratados com um regime de tratamento curativo, como BZ 100 mg/kg por 20 dias, nenhum sinal bioluminescente é detectado mesmo sob imunossupressão. Portanto, considerando que após promover condições para o sinal bioluminescente subir acima do nível limite de 1000 parasitas10 e aumentar a sensibilidade pela exposição dos órgãos viscerais, considera-se que BZ 100 mg/kg por 20 dias proporciona cura estéril. A avaliação da cura estéril foi previamente validada por diferentes técnicas 10,13,17,33,34. Um desenho de estudo semelhante foi aplicado ao modelo crônico (Figura 5A), no qual camundongos (n = 6 / grupo) começaram a ser tratados no dia 100 pós-infecção. Neste ponto, Posa 20 mg / kg, BZ a 100 mg / kg ou 10 mg / kg uma vez ao dia foram administrados por via oral por 20 dias. Após o período de eliminação da droga, os camundongos BLI-negativos foram imunossuprimidos. Além disso, para avaliar a cura estéril, camundongos que ainda eram negativos para BLI no final da fase de imunossupressão foram submetidos a análise ex vivo . Na infecção crônica, o tratamento com Posa a 20 mg / kg levou a uma diminuição de 95,03% ± 6,18% na carga parasitária inferida por bioluminescência no final do tratamento e permaneceu em níveis semelhantes de camundongos não infectados durante o período de eliminação do medicamento. Após a imunossupressão, a maioria dos camundongos apresentou um nível variável de sinal e distribuição de BLI (Figura 5B). O procedimento ex vivo revelou que um camundongo BLI negativo de corpo inteiro tratado com Posa tinha uma mancha bioluminescente no cólon detectável por meio de exame ex vivo ( Figura 5C ). Figura 5: Desenho do experimento de avaliação de drogas e resultados alcançados no modelo crônico de infecção por Trypanosoma cruzi por imagem de bioluminescência. (A) Gráfico esquemático do desenho do experimento do modelo de camundongo com doença de Chagas crônica. Pontos pretos: pontos de tempo de imagem. Frasco de remédio e barra laranja: início e fim do tratamento, respectivamente. Ícone da seringa: injeções de ciclofosfamida. Dpi: dia pós-infecção. Código de cores: Cinza = infecção não tratada; laranja = período de tratamento; azul = fase de eliminação do composto; amarelo = imunossupressão; lilás = recidiva. (B) Avaliação longitudinal da eficácia do tratamento no modelo crônico da doença de Chagas. Painel esquerdo: BLI ventral de camundongos BALB/c (i) não tratados ou tratados por 20 dias com (ii) posaconazol (Posa) a 20 mg/kg; (iii) benznidazol (BZ) a 100 mg/kg e (iv) BZ a 10 mg/kg (n = 6/grupo). Todos os tratamentos foram administrados por via oral por gavagem uma vez ao dia. Gráfico à direita: soma dos dados brutos do fluxo total ventral e dorsal. Chave: frasco de medicamento: início do tratamento (102 dpi); barra laranja: final do tratamento (121 dpi); Ícone amarelo da barra e da seringa: injeções de ciclofosfamida (do dia 131-142). Ponto laranja: camundongo analisado por procedimento ex vivo . ! camundongo morreu durante a anestesia. O camundongo exibe anormalidades abdominais. A escala do mapa de calor (Log10) indica a intensidade da bioluminescência na unidade de radiância de baixo nível (3 × 105 como azul) a alto (1 × 107 como vermelho). (C) Análise ex vivo do tropismo de T. cruzi em tecido. Detecção de bioluminescência de órgãos excisados de camundongos imunossuprimidos in vivo BLI-negativos após tratamento com Posa e BZ a 100 mg / kg ou camundongos com o sinal mais baixo em grupos não tratados e BZ a 10 mg / kg. A chave de distribuição da placa é mostrada na parte inferior da figura (criada com BioRender.com: ZY26LG8AOF). A escala de radiância é igual ao painel in vivo . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. O tratamento com BZ a 100 mg/kg reduziu a bioluminescência a níveis limiares (93,87% ± 2,14%) a 122 dpi e encaminhou até o final do experimento. Considerando a análise ex vivo , BZ alcançou uma taxa de cura de 100% (6/6 camundongos), pois nenhum camundongo apresentou retorno do sinal bioluminescente mesmo quando imunossuprimidos e órgãos internos foram examinados. Isso significa falta de recaída. No entanto, o regime de tratamento com BZ com uma concentração mais baixa resultou em uma ligeira redução da bioluminescência (85,95% ± 18,43%), mas sem cura, pois os camundongos continuaram a mostrar focos de sinal bioluminescentes detectáveis em todos os pontos de tempo subsequentes. Assim, este modelo permite a diferenciação quantitativa entre tratamentos ineficazes (posaconazol e tratamento subótimo com benznidazol) e tratamentos eficazes (dosagem ideal e duração do tratamento com benznidazol). Figura suplementar 1: Análise pré-infecção da expressão populacional de luciferase por T . cruzi por medição da fluorescência mNeonGreen do gene repórter. Citometria de fluxo da proteína fluorescente mNeonGreen expressa constitutivamente pelo parasita CL Brener Luc::Neon. Histograma normalizado do número de parasitas (eixo Y) pela intensidade de fluorescência mNeonGreen (eixo X). A legenda interna demonstra a cepa e a forma analisadas, a mediana de fluorescência e a porcentagem da população de fluorescência. As linhas de portão são definidas pela cepa do tipo selvagem CL Brener (WT) como controle não fluorescente. Clique aqui para baixar este arquivo. Tabela Suplementar 1: Exemplo de tabela de análise na medição do IVM. Dados brutos obtidos da quantificação por imagem de bioluminescência do dia 19 pós-infecção no modelo agudo usado nos resultados representativos mostrados na Figura 4B. Descrição dos grupos: Controle como camundongos não infectados (n = 3/grupo); veículo como camundongos infectados não tratados; posaconazol (Posa) a 20 mg/kg durante 20 dias; benznidazol (BZ) a 100 mg/kg por 20 dias; BZ a 100 mg/kg tratado por 5 dias (n = 6/grupo). Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

A imagem de bioluminescência é um método inovador que permite a detecção de um gene de relatório usando um espectro visível e infravermelho de radiação eletromagnética. Portanto, não há necessidade de marcadores radiomarcados para rastrear sua amostra35. O BLI é adequado para modelos de roedores e outras espécies pequenas. É muito útil para estudos pré-clínicos porque é mais seguro e permite várias rodadas de imagem, causando o mínimo de desconforto ao animal. Além disso, a imagem in vivo é muito flexível devido à possibilidade de combinar bioluminescência, fluorescência e outras técnicas, como a tomografia por emissão de pósitrons36.

A imagem óptica é governada por propriedades físicas ópticas, como absorção e espalhamento. Todos os tecidos absorvem e espalham luz de comprimentos de onda distintos de maneira diferente37. Um passo crítico é selecionar um gene repórter sem levar em conta o comprimento de onda emitido da luz produzida pela reação química. Embora um nível de expressão do gene repórter possa ser alto in vitro em ensaios bioluminescentes, os mesmos níveis de expressão podem não ser alcançados ao progredir para o ambiente in vivo. Neste protocolo, usamos a versão otimizada para códon de Photinus pyralis luciferase (PpyRE9H)38 com desvio para o vermelho para tripanossomatídeos9, que emite luz a 617 nm, uma das mais adequadas para estudos in vivo 39. Comprimentos de onda maiores que 600 nm são menos absorvidos e espalhados pelos cromóforos endógenos do corpo, especialmente hemoglobina e melanina. Assim, as luzes vermelhas podem ser transmitidas através de vários centímetros de tecido, permitindo que os fótons cheguem à câmera CCD mesmo de dentro dos tecidos viscerais39,40.

Uma área de preocupação em ambientes de imagem é a falta de uma compreensão abrangente de sua função e efeitos. Binning, uma técnica de pré-processamento, combina as informações adquiridas por detectores contíguos em um pixel maior. Esse processo melhora a relação sinal-ruído, reduzindo o ruído de fundo e melhorando a sensibilidade. No entanto, diminui a precisão da resolução espacial, resultando em uma imagem pixelada41,42. Essa compensação é uma consideração importante em sua estratégia de imagem.

Com base no Perfil do Produto Alvo e no Perfil do Candidato Alvo para a doença de Chagas34, o estudo de prova de conceito está focado na sensibilidade para detectar o T. cruzi e ajudar a estabelecer se um novo candidato a medicamento pode alcançar uma cura estéril (representada pela falta de recidiva após várias rodadas de imunossupressão). Portanto, executamos o BLI usando o fator de binning mais alto sem supersaturar a imagem. Quando a imagem supersatura, uma nova aquisição é realizada usando um fator de binning mais baixo. Durante a análise, uma correção matemática é aplicada às imagens que exigiram binning diferente. Dessa forma, os dados finais devem ser apresentados usando o mesmo binning. A Tabela 1 demonstra os diferentes valores obtidos quando fatores binning distintos foram aplicados na mesma imagem e ROIs.

Tabela 1: Influência das configurações de binning na quantificação do BLI. Quantificação de três ROIs na imagem do modelo agudo (d13) e do modelo crônico (d118), analisadas em diferentes fatores binning. Clique aqui para baixar esta tabela.

Devido ao cenário atual da doença de Chagas na clínica, os esforços de descoberta de medicamentos visam eliminar completamente os parasitas (cura parasitológica)27,34. Portanto, o protocolo pré-clínico in vivo inclui abordagens que superam as limitações da sensibilidade técnica do BLI. Uma das abordagens é tratar os camundongos com ciclofosfamida para diminuir a resposta imune que controla a carga parasitária. Outra estratégia é diminuir a profundidade do tecido e remover camadas de músculos, pele e pêlo que obstruem o caminho da luz para a câmera. Através do procedimento ex vivo, pequenas manchas bioluminescentes podem ser detectadas, revelando focos parasitários abaixo do limiar de BLI in vivo, como mostrado na Figura 5C em resultado ex vivo de camundongo tratado por Posa.

Projetar um experimento piloto para avaliar o próprio modelo e a dinâmica da infecção é crucial para estabelecer um experimento preciso para a avaliação da eficácia do medicamento antiparasitário. Assim, o pesquisador poderá definir as configurações adequadas de BLI e o curso do tempo de infecção com antecedência. Em um experimento exploratório, uma ferramenta que pode ser útil para definir as configurações de aquisição é a ‘Exposição automática’. Com essa ferramenta, o pesquisador estabelece a prioridade de três configurações (Tempo de exposição, Binning e F/Stop) para adquirir a melhor imagem possível. Em particular, o pesquisador deve garantir que as imagens sejam adquiridas dentro da faixa dinâmica da câmera CCD, sem supersaturação ou subexposição, o que pode ser verificado através dos limites mínimo e máximo da escala e do recurso de autoexposição (Menu Editar > Preferências > Aquisição de Guias > Exposição Automática de Abas). Nesse protocolo, a abertura da câmera foi ajustada no valor máximo (F/Stop: 1), e diferentes tempos de exposição e fatores binning foram definidos para modelos agudos e crônicos. Essas configurações fornecem previsibilidade de tempo para executar diferentes rodadas de imagem simultaneamente. Considerando que o método repórter é baseado em uma reação enzimática, tanto a biodistribuição do substrato no camundongo quanto a cinética da luciferase influenciam o sinal bioluminescente e, portanto, a quantificação da infecção (Figura 1B). Consequentemente, a aquisição de imagens em diferentes momentos da cinética enzimática introduz variabilidade de dados que não pode ser contabilizada ou corrigida e afeta o cálculo do fluxo total (fótons/segundo) ou radiância (fótons/segundo/cm2/esterradiano). Além disso, a infecção por T. cruzi exibe posicionamento espacial dinâmico em camundongos (diferentes áreas e tecidos, profundidade e carga parasitária). Portanto, estabelecer um valor de contagens a serem adquiridas pode perder fontes de sinal mais fracas (baixo número de parasitas em um determinado ponto mais profundo do tecido) se a fonte de outro sinal mais forte atender aos critérios de auto-exposição definidos.

Um recurso complicado do software Living Image é exibir a imagem adquirida em uma escala de cores automática. Não há opção para pré-definir a escala para exibir automaticamente uma nova imagem adquirida de acordo com os valores de escala selecionados (consulte a etapa 6.2 do protocolo). Essa situação obriga o pesquisador a alterar manualmente as imagens, uma a uma, para os valores máximos e mínimos escolhidos. Como consequência, os usuários não experientes e não bem treinados não têm a leitura adequada durante a sessão de aquisição e podem enganar os dados ou perder informações importantes naquele momento. Para isso, o experimento piloto é benéfico.

Uma das perguntas mais comuns sobre o projeto do experimento de prova de conceito é como escolher a duração e a dose do tratamento. Para novas entidades químicas, esses parâmetros são geralmente definidos pela potência e seletividade do composto in vitro, em combinação com dados gerados pelo metabolismo e farmacocinética do medicamento (DMPK) e estudos de tolerabilidade conduzidos antes do teste in vivo para eficácia. Em resumo, após a identificação de compostos capazes de matar seletivamente o parasita no interior das células, os primeiros experimentos de ADME (absorção, distribuição, metabolismo e excreção) são realizados in vitro para estimar a solubilidade aquosa dos compostos, a permeabilidade celular e a estabilidade metabólica, entre outros parâmetros. Se os compostos mostrarem um bom equilíbrio de propriedades in vitro (geralmente definidas em perfis de candidatos-alvo), então esses candidatos são progredidos para estudos de farmacocinética in vivo (PK) em camundongos saudáveis, que descrevem a exposição do composto no sangue (e possivelmente também nos tecidos) e fornecem uma ideia geral da tolerabilidade em diferentes níveis de dose17, 34,43. Idealmente, o objetivo da avaliação farmacocinética na maioria das doenças infecciosas é determinar a viabilidade de atingir concentrações plasmáticas livres (corrigidas para ligação às proteínas plasmáticas) que estão acima das concentrações EC50 / EC90 44 – a concentração efetiva que mata ou pelo menos inibe o crescimento de 50% ou 90% dos parasitas, respectivamente – por um período de tempo suficientemente longo. Se for alcançada exposição suficiente em um determinado nível de dose, esse regime pode ser usado durante os estudos de eficácia usando o modelo Chagas BLI. Para estudos de reposicionamento de medicamentos, devem estar disponíveis dados farmacocinéticos in vitro e in vivo. Um bom começo para o reperfilamento de medicamentos são os bancos de dados químicos, como o PubChem45, que fornecem dados reconhecidos que podem ser convertidos em camundongos usando escala alométrica46 para estimar regimes de tratamento seguros e não tóxicos a serem testados. No entanto, nem sempre é esse o caso. Os estudos de PK ainda são um campo negligenciado na ciência acadêmica, e poucas empresas farmacêuticas publicam seus resultados de PK. A comunidade científica de descoberta de medicamentos recomenda incluir a avaliação farmacocinética in vivo junto com ensaios de eficácia de medicamentos (farmacodinâmica)47. Portanto, a imagem pré-clínica é compatível com medições compostas simultaneamente, e essa abordagem associada aumenta a robustez dos dados.

Além disso, o manuseio, o peso e as condições de saúde dos camundongos são monitorados durante todo o experimento. Sinais de toxicidade e efeitos colaterais, como curvatura, tremor, perda de equilíbrio, falta de vontade de se mover, relutância em alimentar ou beber, prostração ou quaisquer outras anormalidades presentes no grupo ou por condições individuais de camundongos, devem ser registrados e relatados em estudos pré-clínicos. Um dos objetivos da imagem óptica é garantir o bem-estar dos animais. Assim, os parâmetros humanos devem ser aplicados em camundongos com sinais de dor descritos na escala ‘Grimace48. Além disso, os camundongos foram pesados semanalmente durante a aquisição do BLI e, mais frequentemente, durante a dosagem do medicamento e o tratamento com CTX. Seguindo os regulamentos de bem-estar animal, os camundongos que perdem mais de 20% do peso corporal devem ser imediatamente sacrificados humanamente.

O modelo bioluminescente do T. cruzi é hoje o modelo experimental de última geração para a descoberta e desenvolvimento de novos tratamentos para a doença de Chagas. Modelo que replica as principais características da infecção por T. cruzi e da doença de Chagas49, permitindo o monitoramento em tempo real da parasitemia e a diferenciação de compostos com perfis de eficácia variados associados a modos de ação conhecidos. O BLI é uma técnica que aumenta a assertividade na identificação de tecidos infectados. Permite a seleção precisa de tecidos infectados para serem utilizados em uma ampla gama de abordagens, incluindo todos os métodos clássicos já aplicados na pesquisa do T. cruzi 50,51. Além disso, permite que os pesquisadores explorem tecnologias de ponta e desenvolvam novas33. Além disso, o BLI proporciona melhoria do bem-estar animal e uso mais racional de acordo com os princípios dos 3Rs10,35, tudo de uma só vez.

Vários grupos de pesquisa focados em doenças tropicais negligenciadas são colocados em países onde os dispositivos de imagem in vivo não estão disponíveis. Para superar o cenário atual, novas redes internacionais como a Global BioImaging e seus consórcios associados promovem ações para fornecer acesso aberto às instalações centrais de imagem e melhorar a formação de pessoal e cientistas de imagem 52,53. Essas iniciativas, juntamente com protocolos de usuário amigáveis como este, podem oferecer condições que democratizam tecnologias de ponta para todos os pesquisadores. A implementação desse método na descoberta pré-clínica de medicamentos ofereceu uma sólida leitura de eficácia e valor preditivo do resultado clínico, facilitando a descoberta de medicamentos para a doença de Chagas.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem a Amanda Franscisco, John Kelly e Fanny Escudié por fornecerem treinamento e suporte ao BLI em ensaios de eficácia de medicamentos, John Kelly e Simone Calderano por fornecerem parasitas e Gabriel Padilla pelo apoio em estudos com animais. A.C.S recebeu uma bolsa CAPES PSDE para treinamento na London School of Hygiene and Tropical Medicine (Reino Unido). Os autores também gostariam de agradecer à Plataforma de Pesquisa em Citometria de Fluxo e Imagem (FLUIR) do Centro de Pesquisa Científica da Universidade de São Paulo (CEFAP-USP) pelo apoio técnico na análise do equipamento IVIS Spectrum, e ao Laboratório de Genética e Controle Sanitário ICB-USP pelos ensaios pós-experimentação para controle de qualidade de camundongos como livres de patógenos específicos. Este projeto foi financiado pela DNDi. A DNDi agradece aos seus doadores, públicos e privados, que forneceram financiamento para todas as atividades da DNDi desde sua criação em 2003. Uma lista completa dos doadores da DNDi pode ser encontrada em https://dndi.org/about/donors/.

Materials

BD LSRFortessa™ X-20 Cell Analyzer BD Biosciences
Weighing Balance (animal facility) Available from several suppliers
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Revvity (former PerkinElmer)
FlowJ Software v10.7.1 BD Biosciences
Living Image Software for Spectrum v4.7.1 Revvity (former PerkinElmer) License Free Analysis Software called 'Aura Imaging' could be used for the most basic features provided by Spectral Instruments Imaging (Bruker company) (https://spectralinvivo.com/software/)
Microsoft Office software Microsoft
GraphPad Prism v8.4.0 GraphPad Software Inc.
DMEM Low Glucose Vitrocell D0025
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761-500G
Foetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000-044
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Trypsin 0.5% EDTA Gibco 25300-062
LIT medium In house
Hygromycin B (50 mg/mL) Gibco 10687010
Grace′s Insect Medium Sigma-Aldrich  G9771
HEPES Sigma-Aldrich  54457
IVISBrite d-luciferin potassium salt Revvity (former PerkinElmer) 122799 Also could be used: VivoGlo Luciferin, in vivo grade (Promega/P1043); D-Luciferin, Monopotassium Salt (Thermo Scientific/88293) or PierceD-Luciferin, Monosodium* Salt (Thermo Scientific/88291); D-Luciferin, Potassium Salt (GoldBio/LUCK or eLUCK); D-Luciferin, Sodium* Salt (GoldBio/LUCNA or eLUCNA) *Sodium or potassium salt differences relies minimal chances on solubility, however do not affect in vivo performance. 
DPBS Gibco 21600-044
Cyclophosphamide (CTX) Sigma-Aldrich C0768-5g
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D5879
(Hydroxypropyl)methyl cellulose (HPMC) Sigma-Aldrich 09963-25G
Benzyl alcohol Sigma-Aldrich 402834
Tween 80 Sigma-Aldrich  P1754-1L
Benznidazole ELEA
Posaconazole (Noxafil commercial formulation) Schering-Phough
Giemsa Available from several suppliers
gavage needle (stainless-steel straight) – 22GA Aton  CA2003
1 mL Syringe and 31G needle Available from several suppliers
1 mL Syringe and removable 26G needle Available from several suppliers
1 mL Syringe and removable 24G X¾ needle Available from several suppliers
Sterile Syringe Filter 0.2 µm Available from several suppliers
A4 Matte Black paper 120gr or thicker Paper Color/ Canson (Available from several suppliers)
aluminum foil Available from several suppliers
Neubauer chamber Available from several suppliers
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References

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da Silva, A. C., Kratz, J. M., Morgado, P. G. M., Freitas-Junior, L. H., Moraes, C. B. Demystifying In Vivo Bioluminescence Imaging of a Chagas Disease Mouse Model for Drug Efficacy Studies. J. Vis. Exp. (207), e66740, doi:10.3791/66740 (2024).
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