약물 효능 연구를 위한 샤가스병 마우스 모델의 In Vivo Bioluminescence 이미징 Demystifying In Vivo Bioluminescence Coaching

이 프로토콜에 설명된 모든 절차는 Universidade de São Paulo의 Instituto de Ciências Biomédicas의 동물 윤리 위원회가 사전 승인한 지침14 (프로토콜 CEUA ICB/USP no 5787250522)에 따라 제출, 승인 및 수행되었습니다. 1. 솔루션 참고: 10mL/kg(마우스 20g 무게의 경우 200μL)15,16의 사전 조절된 관리 용량을 고려하십시오. 예를 들어, 150mg/kg의 동물 투여량에 도달하기 위해 15mg/mL의 작업 용액을 준비합니다. 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 현탁액 차량(HPMC-SV)참고: 필요한 시약은 0.5%(w/v) 하이드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC), 0.4%(v/v) 트윈 80 및 0.5%(v/v) 벤질 알코올입니다.200mL의 차량 용액의 경우 HPMC 1g의 무게를 측정하고 64mL의 뜨거운 초순수에 녹입니다. 2분 동안 저어줍니다. 얼음처럼 차가운 초순수 120mL를 넣고 1시간 동안 저어줍니다. 벤질 알코올 1mL를 추가합니다. 그런 다음 역 피펫팅 기법을 사용하여 Tween 80 0.8mL를 추가하고 용액이 투명해질 때까지 계속 저어줍니다. 최종 부피 200mL에 맞게 용액을 조정합니다. HPMC-SV를 최대 4개월 동안 냉장(4°C)하여 보관합니다. 벤즈니다졸다음과 같이 필요한 복합 용액의 양을 계산하십시오.복합 용액의 부피 = (각 일의 투여 횟수 x 일수 x 치료할 마우스 수 x 각 마우스의 투여 용량) + 30% 추가. 원하는 복용량을 고려하여 필요한 양의 벤즈니다졸(BZ)을 계량합니다. 근치적 치료의 경우, 10일 동안 1일 1회 100mg/kg을 경구 투여하면 CD 만성 모델17에서 100% 완치를 달성할 수 있습니다. 원하는 최종 부피를 고려하여 5%(v/v) DMSO의 농도에 도달하기 위한 적절한 양을 계산하고 BZ를 깔끔한 DMSO에 완전히 용해시킵니다. 95%(v/v) HPMC-SV 농도에 도달하기 위해 유리관에 적절한 부피의 차량을 추가합니다. DMSO에 용해된 BZ를 HPMC-SV가 포함된 유리관으로 옮깁니다. 현탁액을 강력하게 균질화하고 4 °C에서 보관하십시오.예: BZ 제형의 최종 부피 = 10mL(단계 1.2.1)BZ의 양 = 100 mg (단계 1.2.2)5% DMSO = 0.5mL(단계 1.2.3) 및 95% HPMC-SV = 9.5mL(단계 1.2.4) 각 약물 투여 전에 제형을 37°C에서 5분 동안 초음파 수조에 넣고 동물 투여 전에 강력하게 균질화합니다. 사이클로포스파마이드(Cyclophosphamide)필요한 양의 사이클로포스파마이드를 초순수에 용해시켜 12.5mg/mL 용액을 얻습니다. 여과로 용액을 멸균하고 4°C에서 보관합니다. Giemsa 얼룩메탄올 50mL에 Giemsa 분말 시약 0.6mg을 녹입니다. 글리세롤 25mL를 넣고 섞는다. 여과지와 깔때기를 사용하여 침전물을 제거합니다. 원액을 빛으로부터 보호된 실온(RT)에서 보관하십시오. Mix-Phosphate Buffer 90 mL (pH 7.2에서 20.5 M Na2HPO4, 65.4 M KH2PO4 )에 10 mL의 Giemsa 용액을 희석하여 작업 용액을 준비합니다. 2. 트리파노소마 크루지 문화 생물 안전 작업대(BSC)에서 작업하여 LIT 배지(68.44mM NaCl, 5.36mM KCl, 112.7mM Na2HPO4, 5g/L 트립톤, 5g/L 간 주입 육수, 0.03M 헤민, 4.16mM 포도당)에서 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 T. cruzi CL Brener Luc::Neon11의 4 x 106 epimastigotes/mL를 배양합니다. 100 μg/mL 페니실린, 100 U/mL 스트렙토마이신 및 150 μg/mL 히그로마이신은 28°C에서 선택적 약물입니다. 기생충은 일반적으로 3-4일 내에 정지 단계에 도달합니다. 7-10일 동안 28°C에서 15mL 원뿔형 튜브에 10%(v/v) FBS와 함께 10mL의 Grace’s Insect 배지에 3 x 108 epimastigotes를 배양하여 감염성 기생충을 얻기 위한 metacyclogenesis를 유도합니다. Giemsa-staining 도말에 의한 분화율을 평가합니다. 이를 위해 분화된 기생충 20μL를 유리 슬라이드에 펴 바르고 10분 동안 건조시킵니다. 흄 후드에서 유리 슬라이드를 깔끔한 메탄올로 덮어 샘플 고정을 진행하고 완전히 건조시킵니다(1-2분). 유리 슬라이드를 Giemsa 작업 용액으로 20분 동안 덮습니다. 유리 슬라이드를 증류수로 부드럽게 씻으십시오. 현미경으로 metacyclic trypomastigotes의 백분율을 계산합니다. 최소 10%의 차별화율이 달성되면 다음 단계로 진행합니다. 기생충을 원심분리하고(10분 동안 120 x g ) 10mL의 DPBS로 펠릿을 재현탁시킵니다. 원심분리를 한 번 더 하고 FBS 10%(v/v), 페니실린 100μg/mL 및 스트렙토마이신 100U/mL가 보충된 DMEM 5mL에 기생충을 재현탁시킵니다. 25cm2 배양 플라스크에서 1.66 x 105 LLC-MK2 세포( Macaca mulatta의 신장 상피 세포)를 37°C에서 5%CO2 의 가습 인큐베이터(18)에서 감염을 수행합니다. 조직 배양 트리포마스티고테스(TCT)는 8-9일 후에 배지에서 방출됩니다. 1:40의 MOI(Multiplicity of Infection)에서 새로운 LLC-MK2 세포 단층을 TCT로 감염시킵니다. 3. 유세포분석기에 의한 Trypanosoma cruzi 집단 균질성 분석 CL Brener Luc::Neon 및 CL Brener 야생형 균주의 TCT를 수집하고 120 x g 에서 10분 동안 원심분리한 후 DPBS에서 TCT를 재현탁합니다. 기생충 밀도를 조정하여 1 x 106/mL를 달성합니다. mNeonGreen 형광(예: 506/em. 517 nm)19을 기반으로 하는 유세포분석기로 집단 분석을 진행하여 각 샘플에 대해 최소 20,000개의 이벤트를 획득합니다.참고: 형광 개체군 비율은 야생형과 형질주입된 기생충을 비교하여 얻은 것입니다. 생쥐 감염을 진행하려면 CL Brener Luc::Neon 계통의 형광 기생충 개체군의 최소 95%를 달성해야 합니다(보충 그림 1). 4. 생쥐 실험 감염 참고: 기생충의 양을 늘리기 위해, 혈류 트리포마스티고테스(BT)는 면역 결핍 마우스에서 자주 얻어진다10,13. 여기에서 BALB/C 마우스의 화학적 면역억제를 사용하여 BT를 얻습니다. 이를 위해 96시간 간격으로 62.5mg/kg의 사이클로포스파마이드(CTX)를 복강내 주사로 4회 투여하여 경미한 면역억제를 달성하며, 이는 T. cruzi 감염과 동시에 수행됩니다. T. cruzi 감염 1일 전에 복강 내 주사(i.p.)로 멸균 사이클로포스파마이드 62.5mg/kg을 투여합니다. 복강 내 경로를 통해 0.2mL의 DPBS에 1 x 104 TCT로 각 마우스를 감염시킵니다. 병원체와 바늘을 다룰 때 사고의 높은 위험에주의하십시오. 전체 절차 동안 장갑과 안면 보호대를 착용하고 BSC에서 감염을 수행합니다. 혈액 내 BT를 직접 관찰하여 매일 기생충혈증을 모니터링합니다(Pizzi-Brener 방법)20. 감염 후 약 13-17일(dpi)이 기생충혈증이 최고조에 달할 때 혈액 채취를 실시합니다. 이를 위해 100mg/kg 케타민과 10mg/kg 자일라진으로 마우스를 마취합니다. 마우스가 완전히 마취되면21, 3.8%(w/v) 구연산나트륨 50μL가 포함된 24G X3/4 바늘에 부착된 1mL 주사기를 사용하여 심장 천자를 진행합니다. 바늘의 플러그를 뽑고 혈액을 원심 분리기 튜브에 부드럽게 넣으십시오. BSC에서 암모늄-염화물-칼륨(ACK) 용해 완충액에서 혈액 부분 표본을 희석하고 Neubauer 챔버의 기생충을 계산합니다. 작은 혈전이 기생충 계산에 영향을 미치므로 이 과정을 최소 두 번 반복하십시오.알림: 계수 오류를 방지하려면 Neubauer 챔버에서 30 미만 및 300 트리포마스티고트 보다 높은 계수를 피하기 위해 희석 계수를 조정하십시오. DPBS에 필요한 양의 순수한 혈액을 혼합하여 기생충 밀도를 5 x 103 BT/mL로 조정합니다. 26G 바늘을 사용하여 복강 내 경로로 마우스당 0.2mL의 DPBS(5 x 103 BT/mL)에 1 x 103 BT로 면역이 억제되지 않은 BALB/c 마우스를 감염시킵니다(바늘이 좁을수록 기생충 용해가 발생함)22. 복강내 볼륨을 주입한 후 역류를 방지하기 위해 바늘을 마우스 내부에 5초 동안 유지합니다. 감염된 쥐를 종이 타월이 있는 상자에 임시로 넣어 누출 또는 출혈 가능성을 확인한 다음 쥐를 우리로 되돌려 보냅니다. 5. 생체 내 이미징 참고: 여기에 사용된 용어의 용어집은 다음과 같습니다. 이미징 세션: 주어진 날짜에 특정 실험의 모든 그룹에서 수행된 생물 발광 획득. 그림 1A 는 절차의 개요를 보여줍니다. 이미징 라운드: D-루시페린 주입에서 마취 회복에 이르기까지 3마리의 마우스로 구성된 하위 그룹에서 수행된 절차. 각 실험 그룹에는 6마리의 마우스가 포함되는 것이 권장되는데, 이는 마우스의 기생충 부하에 대한 내재적 변동성 및 아래에 설명된 BLI 정량화에 영향을 미치는 기타 요인 때문입니다. 이미징 획득: 생물 발광을 정량화하기 위해 이미징 장비에 의해 수행되는 사진 촬영으로, 그 결과 사진의 이미지 오버레이와 정량화된 생물 발광이 유사 색상 척도로 표시됩니다. 이미징 절차: 프로토콜의 이 세션에서 논의된 모든 단계. 그림 1: BLI 데이터 획득. (A) 감염성 질환 연구에 적용된 획득 워크플로우 다이어그램, 샤가스병 생물 발광 마우스 모델을 예로 들었습니다. 유전자 변형 T. cruzi 에 감염된 마우스는 설정된 시점에서 생체 내 이미징으로 분석됩니다. 각 이미징 라운드에서 최대 3개의 마우스 그룹에 150mg/kg의 효소 기질(D-루시페린)을 주입합니다. 5분 후 산소 중 2.5%(v/v) 이소플루란으로 마취를 실시합니다. 완전히 움직이지 않으면 마우스를 이미징 시스템에 배치하고 정의된 설정에 따라 수집을 시작합니다. 이미징 후 마우스는 마취에서 회복되어 케이지로 돌아갑니다. 연구자가 습득 중에 가질 수 있고 직면할 수 있는 빈번한 질문과 문제는 빨간색으로 강조 표시됩니다. 이 체계는 Lewis et al. (2014) 12 (BioRender.com : UD26KWEVS2로 생성)에서 수정되었습니다. (B) D-루시페린/적색편이 반딧불이 루시페라아제(PpyRE9h)의 생체 내 동역학. T. cruzi parasitemia 피크(n=3)에 있는 마우스를 마취하고 150mg/kg D-루시페린을 주사하였다. 이미지는 1시간(노출 시간: 2분, 비닝: 4) 동안 획득했습니다. 상단: 복부 총 플럭스(p/s) 정량화(왼쪽 Y축, 빨간색) 및 가장 높은 평균 측정의 백분율(오른쪽 Y축, 파란색). 데이터는 평균(곡선) 및 표준 편차(음영 영역)로 표시됩니다. 하단: 첫 번째(4분), 가장 높은 BLI 신호(30분) 및 마지막(62분) 시점의 획득 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. Acquisition 창의 녹색 막대를 확인하여 CCD(Charge-Coupled Device) 카메라가 차가운지(-90°C) 확인합니다. 막대(녹색 또는 빨간색)를 클릭하여 온도를 시각화합니다.알림: 이미징 장비 설명서에 따르면 이미징 장비와 소프트웨어는 CCD를 차갑게 유지하기 위해 항상 켜져 있어야 합니다. 자동 배경 조정이 수행되었는지 확인합니다. 이렇게 하려면 Acquisition > Background > View available Dark Charge를 클릭하십시오. 여러 설정 조합이 있는 목록이 나타납니다.참고: 이 절차는 발광 노이즈를 줄입니다. 선택한 구성의 결과가 1000보다 큰 값이면 “노출 시간 x (binning²)” 공식에 따라 암흑 충전을 무시해서는 안 됩니다. 소프트웨어 구성에 따라 범주화는 숫자(범주화 계수) 또는 ‘small’에서 ‘large’까지의 범위로 표시될 수 있습니다. 범위와 비닝 계수 간의 일치는 장치 설명서에서 찾을 수 있습니다. Activity Window(활동 창)(소프트웨어 하단의 흰색 영역)가 표시되지 않으면 Activity Window(활동 창) > Menu View(메뉴 보기)에서 활성화합니다. Acquisition Window > Field of View를 클릭하여 이미징 영역을 설정합니다. 옵션 C(13.2cm)는 3마리의 마우스를 획득하고 옵션 D(22cm)는 5개의 마우스를 획득합니다. Acquisition > Auto-Save를 클릭하여 자동 저장 옵션을 선택하고 각 시점에 대해 새 폴더를 선택하거나 생성합니다. 이미징 영역에 무광택 검정 용지를 놓고 칸막이 슬라이드를 입구 사이에 수직으로 놓습니다. 제조업체에서 슬라이드를 제공하지 않은 경우 무광택 검정 용지 조각(3cm x 15cm)을 사용합니다. 이미징 챔버의 내부 영역을 조정하여 유리 코콘을 마취 입구에 수용합니다. 작은 검은색 전기 테이프를 사용하여 마취 시스템을 플랫폼(이미지 영역 외부)에 부착합니다.참고: 일부 버전의 이미징 장치에서는 레이저가 이미징 영역을 정의합니다. 이 도구를 사용할 수 없는 경우 소프트웨어를 통해 이미지를 획득하여 이미징 영역 내의 파티션 슬라이드를 확인하십시오. 이미징 및 유도 챔버를 위해 이소플루란 기화기를 산소의 2.5%(v/v)로 설정합니다. 가스가 시스템21을 통해 흐르고 있는지 압력 게이지로 확인하십시오.참고: 이미징 장치에 흡입 마취 시스템이 부착되어 있지 않은 경우 주사 가능한 자일라진 및 케타민23과 같은 다른 마취 옵션이 가능합니다. 이 경우 생쥐의 회복이 느리고 사망 위험이 높습니다24. 주사기(31G 바늘)에 D-루시페린(D-루시페린을 제조하기 위한 포괄적인 프로토콜은 여러 공급업체에서 제공함)25,26을 채우고, 직사광선으로부터 보호하고, 내부를 종이 타월로 덮어 몇 개의 플라스틱 용기나 추가 케이지를 준비합니다. 시간을 쉽게 추적할 수 있도록 시계/시계를 가까이에 두고, 시술 중 마우스 그룹, 루시페린 주입 시간 및 기타 정보를 등록할 수 있는 실험실 노트북을 두십시오. 모든 쥐의 무게를 측정하고 체중을 등록합니다. 꼬리에 펜 마커 또는 문신으로 각 마우스를 표시하십시오. 전체 실험 동안 쥐 식별을 잘 표시하십시오. 이 단계는 인수 전날에도 수행할 수 있습니다.알림: 잉크가 생물 발광 신호를 방해할 수 있으므로 마크가 큰 신체 영역을 차지해서는 안 됩니다. 다른 색상의 영구 마커도 그룹을 구별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이미징 세션을 시작하려면 배경 발광 이미지를 등록합니다(설정: 노출 시간: 5분; 비닝: ‘large’ 또는 ’16’, f/stop: 1) 마우스가 없는 이미징 챔버. 이 절차는 자동 발광 광원 또는 장비에서 원치 않는 문제를 식별하는 데 도움이 됩니다.참고: BLI는 효소 반응을 기반으로 하기 때문에 시간은 실험의 필수 기능입니다. 동물 취급을 시작하기 전에 위에 나열된 모든 항목과 장비 설정을 확인하십시오. 처음 3마리의 쥐에 D-루시페린 150mg/kg(i.p.)을 주입하고 내부 장기에 도달하지 않도록 합니다. 마우스를 용기 상자에 넣어 D-루시페린이 누출되는지 여부를 평가합니다(밝은 노란색 용액). 이런 일이 발생하면 메모하고 마우스 그룹과 D-루시페린 주입 시간을 등록하십시오. 5분 동안 기다린 다음 마우스를 마취 유도 챔버로 옮깁니다. 시스템을 켭니다. 쥐가 완전히 마취되는 데 약 3분이 걸립니다(다리, 꼬리 흔들림 등과 같은 반응 없음). 21. 이미징 장치의 도어를 열고 이미징 챔버로의 마취 흐름을 켤 동시에 유도 챔버를 끕니다. 각 마우스를 노즈 콘 위치(마우스 1-3, 왼쪽에서 오른쪽으로)에 놓습니다. 레이저로 표시된 이미징 영역 내부에 복부 쪽이 위로 오도록 마우스를 부드럽게 수용합니다. 적응하는 동안 쥐의 ID와 위치를 확인하십시오. 코뿔에 부분적으로 마취된 쥐의 입구를 강제로 넣지 마십시오. 파티션 슬라이드를 마우스 사이에 놓고 이미징 장비의 도어를 닫습니다. 소프트웨어 획득 창에서 다음과 같이 획득 설정을 조정합니다.감염되지 않은 마우스의 경우 노출 시간 = 5분 / 비닝 = ‘large’ 또는 ’16′(임계값을 설정하기 위해 수학적으로 가장 민감한 구성 집합). 급성 모델에서 감염된 마우스의 경우: 노출 시간 = 2분/ 비닝 = ‘중간’ 또는 ‘4’. 만성 모델에서 감염된 마우스의 경우: 노출 시간 = 5분/ 비닝 = ‘large’ 또는 ’16’. D-루시페린 주입 시간이 획득을 시작하기 최소 10분 전에 수행되었는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 루시페라아제 신호의 피크 동안 이미지를 얻는 데 필요한 기간을 기다립니다(그림 1B). 그렇지 않으면 Acquire 를 클릭하여 이미징 수집을 시작합니다. 이미징이 시작된 후 이미지 레이블 창이 나타납니다. 루시페린 주입 시간, 실험, 마우스 식별, 시점 및 기록 유지에 도움이 될 수 있는 기타 원하는 정보를 포함하여 각 그룹에 대한 적절한 정보로 상자를 채웁니다. 이 정보는 측정 테이블 파일에 포함됩니다. 이미징 획득이 끝날 때 경고 기호 Saturated Image(포화 이미지 )가 표시되는지 확인합니다. 채도가 높은 이미지는 허용되지 않습니다. 이 경우 범주화를 줄이고 새 이미지를 가져옵니다. 분석에서 고려해야 할 메모를 작성하십시오. 이미지가 획득되면 이미징 기계 도어를 열고 마우스를 등쪽 보기(뒷면이 위로)로 돌립니다. 획득을 다시 수행하고 적절하게 레이블을 지정합니다. 이 영상 촬영이 끝나면 마취 흐름을 끕니다. 이미징 챔버에서 마우스를 조심스럽게 제거하고 용기에 넣습니다. 마취 회복을 관찰하면서 쥐의 체중을 기록합니다. 시술 중에 발견된 비정상적인 행동이나 신체 이상을 기록하십시오. 쥐가 다시 움직이기 시작하면 새장에 넣으십시오.참고: 획득한 각 이미지의 BLI 강도를 확인합니다. 획득이 종료된 후 기록된 생물 발광 이미지와 사진은 고려해서는 안 되는 자동 스케일과 함께 소프트웨어에 표시됩니다. 도구 팔레트 창에서 데이터 분석(아래 설명 참조)에 정의된 배율을 설정합니다. 6. 데이터 분석 참고: 위의 프로토콜은 상용 생체 내 이미징 소프트웨어를 기반으로 합니다. 그러나 소프트웨어 라이센스가 없는 버전은 가장 기본적인 분석을 수행할 수 있습니다. 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표에서 확인할 수 있습니다. 파일을 엽니다.>Menu File > Browser(브라우저)를 선택하여 특정 이미징 시점에서 획득한 데이터가 포함된 폴더를 엽니다(그림 2A – 1단계).알림: 선택한 파일에 수집된 모든 데이터가 저장된 테이블 형식으로 새 창이 열립니다. 소프트웨어에서 자동으로 제공하는 이미지 ID(데이터 및 시간 번호)인 클릭 번호 기호, 획득 중 이미지 레이블 창에서 연구원이 제공한 정보 및 획득 설정이 표시됩니다. 이러한 모든 데이터는 포화 이미지를 사용해서는 안 된다는 점을 감안할 때 분석에 사용할 수 있는 이미지를 정렬하는 데 도움이 됩니다. 감염되지 않은 컨트롤을 포함하여 선택한 이미지와 관련된 여러 행을 선택합니다. 이미징 세션 중에 등록된 정보와 함께 실험실 노트북에 이미지 ID를 기록합니다. Load as Group(그룹으로 로드)을 클릭하여 선택한 이미지를 조합합니다. 이 절차에서는 새 시퀀스 이미지를 만듭니다. 따라서 모든 이미지의 기능을 동시에 조정할 수 있습니다. 필요한 경우 원시 데이터를 쉽게 재분석할 수 있도록 6.1단계에서 사용한 것과 다른 새 폴더에 새 시퀀스 이미지를 저장합니다. 시퀀스 이미지에서 옵션 > 디스플레이 > 선택 비닝 계수 (Binning Factor )를 클릭하여 각 이미지에 사용되는 비닝을 식별합니다(그림 2A – 2단계). 획득된 비닝 계수는 시퀀스의 각 이미지 상단에 표시됩니다. 모든 범주화 요인을 동일한 숫자로 수정합니다. 이렇게 하려면 조정할 이미지를 두 번 클릭합니다. Tool Palette 창 > Image Adjust 섹션에서 적절한 비닝 계수를 선택합니다(그림 2A – 3단계). 비닝 계수 선택은 5.18단계 참조. 모든 발산 이미지에서 이 절차를 수행합니다.참고: 이 절차는 BLI 정량화(표 1)에 직접적인 영향을 미치며 토론 섹션에서 자세히 설명합니다. 배율을 설정합니다.감염되지 않은 대조군을 기반으로 유효한 생물 발광 신호(장치 설명서에 따라 600 카운트 이상)를 구별합니다. 이를 위해 감염되지 않은 마우스의 이미지를 두 번 클릭하십시오. 그런 다음 새 창의 왼쪽 상단 모서리에서 단위 필드의 개수 옵션을 선택합니다. 그런 다음 색상 눈금을 최소값 600으로 조정합니다. 결과 이미지는 래디언스의 최소 스케일을 설정하는 기준선이 됩니다. 시퀀스 창이 활성화된 상태에서 Units 필드에서 Radiance 옵션을 선택합니다. Tool Palette에서 Color Scale(색상 스케일)과 Color Table(색상 테이블)을 조정합니다. 이를 위해 Color Scale Limits 영역에서 Individual 상자를 비활성화합니다. Logarithmic Scale 및 Manual 상자를 표시합니다(그림 2A – 4단계). 감염되지 않은 대조군(6.8단계에서 관찰된 대로)에 따라 최소 스케일 번호를 설정하고 신호가 가장 높은 영역을 최대로 설정합니다(그림 2A에서 화살표 참조).참고: In vivo 2D light mesurament는 상대적 정량화입니다. 각 장치의 버전 및 보정의 차이로 인해 다른 눈금 값을 찾을 수 있습니다. 따라서 대표 결과에서 나타난 값은 다른 기기에서 수행된 다른 실험과 맞지 않으면서도 내부 통제(비감염 및 감염되지 않은 치료)에 따라 동일하게 유효할 수 있습니다. 모든 이미지에 대해 동일한 배율을 설정한 후 각 이미지를 두 번 클릭하고 창을 최대화한 다음 그래픽 내보내기 버튼을 사용하여 이미지 보기를 이미지 형식(.jpg, .tiff 등)으로 내보내고 treatment_miceID_time점으로 파일 이름을 지정합니다. (그림 2A – 5단계). 모든 이미지에 대해 이 절차를 수행합니다. 측정을 수행합니다.시퀀스에서 이미지를 선택하고 두 번 클릭합니다. 도구 팔레트 창> ROI 도구 섹션에서 사각형 버튼(그림 2B-1단계)을 클릭하고 전체 마우스를 덮는 사각형을 그립니다. 생성된 ROI의 테두리를 클릭하고 각 마우스에 대해 동일한 ROI를 복사하여 붙여넣습니다(이미지에 3개의 ROI가 생성됨). ROI Tools 섹션에서 저장을 클릭하여 ROI를 저장합니다. Apply to Sequence(시퀀스에 적용) 상자를 선택하여 모든 이미지에 대해 저장된 ROI를 적용한 다음 Load(로드)를 클릭합니다. 저장된 ROI는 전체 실험의 모든 마우스에 사용됩니다. 동물이 측정 영역에 더 잘 맞도록 각 마우스의 ROI 위치를 조정합니다. 모든 마우스에 레이블이 지정되면 ROI 측정 버튼을 클릭합니다(그림 2B- 2단계). ROI 측정 표 가 나타납니다. 측정 유형 선택: Radiance; 이미지 속성: 가능한 모든 값; ROI 치수: cm. 그런 다음 모두 선택 버튼을 클릭 한 다음 복사 버튼을 클릭하십시오. 데이터를 테이블 분석 소프트웨어(스프레드시트)에 직접 붙여넣습니다. 또는 .csv 또는 .txt 형식으로 파일을 내보냅니다. 데이터에 대해 작업합니다.표 분석 소프트웨어에서는 데이터를 그룹별로 정리합니다(치료, 대조군, 비감염, 비처리 등). 기생충 부하는 전신 생물 발광으로 표시됩니다. 따라서 동일한 마우스의 ventral 및 dorsal Total Flux 값과 일치하도록 데이터를 정렬하고 합산합니다. 각 그룹을 고려하여 합산된 값의 평균과 표준 편차를 계산합니다(예: 보충 표 1). 데이터를 그래프 작성 및 통계 소프트웨어에 플로팅합니다. 이미지 또는 슬라이드 프리젠테이션 소프트웨어에서 생물 발광 이미지가 있는 패널을 준비합니다. 각 마우스를 열에 배치하고 각 시점을 행에 배치하여 데이터의 시각화 및 해석을 용이하게 하는 약물 효능 매트릭스를 구축합니다.참고: 6.2.4단계(이미지 레이아웃 창 보기)를 수행하지 않고 이미지를 이미징 소프트웨어에 직접 빌드> 수 있는 옵션이 있습니다. 그러나 소프트웨어 인터페이스와 도구는 데이터 구성을 제한합니다. 그림 2: 이미지 스케일 설정부터 발광 정량화까지 데이터 분석 단계. (A) 이미지 데이터 처리를 위한 Living Image Software 보기. 1단계: 브라우저 도구를 사용하여 수집된 데이터를 시퀀스로 업로드합니다. 2단계: 각 획득에 사용된 비닝을 식별합니다(개별 이미지 위에 표시됨). 3단계: 감염된 마우스의 모든 이미지를 동일한 비닝 팩터로 설정하고 감염되지 않은 마우스에 대해 비닝 팩터 16을 적용합니다. 4단계: 화면에 비생물 발광으로 보여야 하는 감염되지 않은 마우스(보라색 화살표)와 빨간색으로 보여야 하는 가장 높은 생물 발광 초점(빨간색 화살표)에서 감염되고 치료되지 않은 마우스를 기준으로 색상 스케일을 수동으로 설정합니다. الخطوة 5 : 작성된 정보가 없는 이미지를 얻으려면 각 이미지를 두 번 클릭하고 그래픽 내보내기 버튼을 사용하여 이미지를 내보냅니다. (B) 관심 영역(ROI) 도구 보기. 1단계: 마우스 전체를 포괄하는 ROI를 그리고 각 동물에 대해 동일한 ROI를 복사하여 붙여넣습니다. 조정된 ROI를 저장하고 실험의 모든 이미지에 적용합니다. الخطوة 2 : ROI 측정 버튼을 클릭하여 .csv 또는 .txt로 내보낼 테이블을 생성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 7. 생체 외 절차 마우스에 150mg/kg D-luciferin i.p.를 주입하고( 생체 외 라운드당 1회) 3분 동안 기다립니다. 100mg/kg 케타민과 10mg/kg 자일라진 ip를 사용하여 마우스를 마취합니다. 생물 안전 작업대에서 쥐가 발을 꼬집어도 전혀 반응하지 않는 경우 쥐 피부를 절단하여 복막강(복막강을 열지 않고)과 왼쪽 겨드랑이 조직을 노출시킵니다. 겨드랑이 동맥과 혈관을 절단하여 출혈을 진행합니다. 일회용 파스퇴르 피펫을 사용하여 혈액을 수집합니다. 그런 다음 심장의 좌심실을 통해 DPBS 용액에 D-루시페린 0.3mg/mL 10mL를 관류합니다. 페트리 접시의 미리 설정된 지점에 선택한 장기를 배치하고 0.3mg/mL d-루시페린 용액에 담그십시오. 이 절차는 최대 30분 이내에 수행해야 합니다. 절제된 장기(심장, 폐, 흉선, 간, 대퇴사두근, 장간막, 비장, 신장, 부신, 내장 지방, 식도, 위, 소장, 맹장, 결장, 뇌, 피하 지방, 자궁, 생식선 지방, 방광 및 복막)의 발광 이미지를 획득합니다(신호 강도에 따라 비닝 16).참고: 임계값을 설정하려면 감염된 마우스보다 감염되지 않은 마우스에 대해 동일한 절차를 수행해야 합니다.