Das hier bereitgestellte Protokoll beschreibt die detaillierten Schritte zur Durchführung von Arzneimittelwirksamkeitsstudien in einem biolumineszierenden Modell der Trypanosoma cruzi-Infektion , wobei der Schwerpunkt auf der Datenerfassung, -analyse und -interpretation liegt. Fehlerbehebungs- und Qualitätskontrollverfahren zur Minimierung technischer Probleme werden ebenfalls bereitgestellt.
Um die Auswirkungen menschlicher Protozoenkrankheiten wie der Chagas-Krankheit, der Leishmaniose und der menschlichen afrikanischen Trypanosomiasis auf die öffentliche Gesundheit zu kontrollieren und zu verringern, ist es notwendig, die Entwicklung neuer Medikamente und Impfstoffe zu beschleunigen. Dieser Prozess ist jedoch mit Schwierigkeiten wie der hochkomplexen Parasitenbiologie und Krankheitspathogenese verbunden und, wie für vernachlässigte Tropenkrankheiten typisch, mit vergleichsweise begrenzten Mitteln für Forschung und Entwicklung. Daher sind In-vitro – und In-vivo-Studienmodelle , die die Schlüsselmerkmale von Infektionen und Krankheiten ausreichend reproduzieren können und gleichzeitig eine rationale Nutzung der Ressourcen ermöglichen, für den Fortschritt der Forschung zu diesen Erkrankungen unerlässlich. Ein Beispiel ist das in vivo Biolumineszenz-Imaging (BLI) Mausmodell für die Chagas-Krankheit, das eine hochempfindliche Detektion von langwelligem Licht ermöglicht, das von Trypanosoma cruzi-Parasiten erzeugt wird, die Luciferase exprimieren. Obwohl diese Technik zum Standardansatz für In-vivo-Studien zur Wirksamkeit von Arzneimitteln geworden ist, könnten Forschungsgruppen immer noch Schwierigkeiten haben, sie umzusetzen, da es an einer angemessenen praktischen Ausbildung in der Handhabung von Geräten und der Anwendung von Qualitätskontrollverfahren mangelt, selbst wenn geeignete BLI-Geräte leicht verfügbar sind. Unter Berücksichtigung dieses Szenarios zielt dieses Protokoll darauf ab, von der Planung von Experimenten bis zur Datenerfassung und -analyse zu führen, mit Details, die die Implementierung von Protokollen in Forschungsgruppen mit wenig oder keiner Erfahrung mit BLI erleichtern, entweder für die Chagas-Krankheit oder für andere Mausmodelle für Infektionskrankheiten.
Die Chagas-Krankheit ist in Lateinamerika endemisch und betrifft weltweit etwa sieben Millionen Menschen1. Jährlich resultieren mehr als 50.000 Todesfälle und wirtschaftliche Verluste von rund 7 Milliarden Dollar aus der Behinderung dieser Krankheit2. Die Chagas-Krankheit wird durch das Protozoon Trypanosoma cruzi verursacht, einen heteroxenischen Hämoflagellaten-Parasiten, der in der Lage ist, Säugetiere (wild und domestiziert) und Triatomin-Vektoren (Hemiptera, Reduviidae)3 in Nord- und Südamerika zu infizieren, wo die vektorielle Übertragung nachgewiesen ist. Weitere wichtige Infektionswege sind Bluttransfusionen, Organtransplantationen, orale (durch die Aufnahme von Lebensmitteln, die mit einem infizierten Triatomin kontaminiert sind)4 und angeborene Übertragung. Nicht-vektorielle Übertragungswege haben zur Ausbreitung der Chagas-Krankheit in nicht-endemische Gebiete beigetragen 3,5.
Die Chagas-Krankheit manifestiert sich in zwei klinischen Phasen. Die akute Phase verläuft in den meisten Fällen asymptomatisch. Symptomatische Infektionen sind in der Regel mit unspezifischen Anzeichen wie Fieber, Müdigkeit, Myalgie, Lymphadenopathie, Splenomegalie und Hepatomegalie verbunden. Die akute Phase ist auch oft mit einer offenen Parasitämie und einer systemischen Zirkulation von Parasiten verbunden. In bis zu 10 % der diagnostizierten Fälle kann es zum Tod kommen, insbesondere bei oralen Infektionen6. Die chronische Phase ist oft durch eine lange Zeit der Abwesenheit von Symptomen gekennzeichnet. Im Laufe der Zeit zeigt etwa ein Drittel der Patienten, die sich Jahrzehnte zuvor infiziert haben, kardiale Manifestationen, die in der Regel von Fibrose und Myokardentzündungen begleitet werden, und/oder gastrointestinale Erkrankungen, die meist mit der Entwicklung von Megaösophagus- und/oder Megakolonsyndromen zusammenhängen 3,5,6.
Die ätiologische Behandlung der Chagas-Krankheit besteht nur aus zwei Medikamenten: Benznidazol und Nifurtimox. Diese Antiparasitika sind seit über 50 Jahren verfügbar und haben eine beträchtliche Toxizität und eine begrenzte Wirksamkeit 5,7,8. Folglich besteht ein dringender Bedarf, neue, sichere und wirksamere Behandlungen für Patienten mit Chagas-Krankheit zu entwickeln.
Ausgefeiltere und genauere Techniken ermöglichen es nun, Antworten auf alte Fragen zu erhalten, die Fortschritte bei der Suche nach neuen Behandlungen für die Chagas-Krankheit ermöglichen. In diesem Sinne profitiert die wissenschaftliche Gemeinschaft stark von gentechnisch veränderten Parasiten für In-vivo-Studien zum Infektionsverlauf und zur Bewertung der Wirksamkeit von Arzneimitteln 9,10,11,12. Ein longitudinaler Assay, der auf dem Biolumineszenz-Bildgebungssystem (BLI) basiert, ermöglicht die Bewertung der Wirksamkeit während und nach dem Behandlungsschema, was zur Identifizierung von Verbindungen mit trypanozider Aktivität führt10,13. Die BLI-Methode ermöglicht eine direkte Messung der Parasitenbelastung, sowohl im Blutkreislauf als auch in Geweben und Organen, durch die Quantifizierung des Lichts, das von der genetisch veränderten T. cruzi CL Brener Luc::Neon-Linie11 produziert wird, die konstitutiv die rotverschobene Glühwürmchen-Luziferase12 exprimiert.
Nichtsdestotrotz dominieren fast 10 Jahre nach der Etablierung des BLI-Tiermodells für die Chagas-Krankheit und der Arzneimittelwirksamkeitsstudien nur wenige Forschungsgruppen diese Technik. Diese Tatsache ist nicht nur auf den eingeschränkten Zugang zu geeigneten bildgebenden Geräten zurückzuführen, sondern auch auf den Mangel an Schulungen und die Verfügbarkeit strukturierter, detaillierter Protokolle. Diese Methode bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Ansätzen, die auf der Beurteilung von Parasitämie durch Mikroskopie, Serologie oder der Bewertung von Organ-/Gewebeinfektionen durch qPCR für den Nachweis von Parasiten-DNA beruhen, da sie ein verbessertes Wohlbefinden von Mäusen und eine Reduzierung des Tierverbrauchs durch die Möglichkeit der Generierung robusterer und integrierter Daten in vivo ermöglicht. Darüber hinaus ist diese Methode wohl sensitiver, da sie eine schnelle Detektion von Parasitenherden in viszeralen Organen nach medikamentöser Behandlung ermöglicht10,12. Daher zielt dieses Protokoll darauf ab, Forschungsgruppen auf dem Gebiet der Parasitologie und anderer Infektionskrankheiten bei der Etablierung dieser Methodik in ihren Laboratorien zu unterstützen, indem die technischen Verfahren detailliert beschrieben werden. Hier teilen wir die Erfahrungen, die wir bei der Implementierung des BLI-Modells für die Chagas-Krankheit in Brasilien gesammelt haben, dem ersten seiner Art in Lateinamerika, im Rahmen der von der Initiative “Drugs for Neglected Diseases” (DNDi) koordinierten Wirkstoffforschung.
Die Biolumineszenz-Bildgebung ist eine bahnbrechende Methode, die den Nachweis eines Berichtsgens anhand eines sichtbaren und infraroten Spektrums elektromagnetischer Strahlung ermöglicht. Daher sind keine radioaktiv markierten Marker erforderlich, um Ihre Probezu verfolgen 35. BLI eignet sich für Nagetiermodelle und andere kleine Arten. Es ist sehr nützlich für präklinische Studien, da es sicherer ist und mehrere Bildrunden ermöglicht, was zu minimalen Beschwerden bei den Tieren führt. Außerdem ist die In-vivo-Bildgebung sehr flexibel, da Biolumineszenz, Fluoreszenz und andere Techniken wie die Positronen-Emissions-Tomographie kombiniert werdenkönnen 36.
Die optische Bildgebung wird von optischen physikalischen Eigenschaften wie Absorption und Streuung bestimmt. Alle Gewebe absorbieren und streuen Licht unterschiedlicher Wellenlängen37. Ein kritischer Schritt ist die Auswahl eines Reportergens, ohne die emittierte Wellenlänge des durch die chemische Reaktion erzeugten Lichts zu berücksichtigen. Während die Expression eines Reportergens in vitro in Biolumineszenz-Assays hoch sein kann, können die gleichen Expressionsniveaus möglicherweise nicht erreicht werden, wenn zur In-vivo-Einstellung übergegangen wird. In diesem Protokoll verwendeten wir eine rotverschobene Photinus pyralis Luciferase (PpyRE9H)38-Codon-optimierte Version für Trypanosomatide9, die Licht bei 617 nm emittiert, eine der am besten geeigneten für in vivo-Studien 39. Wellenlängen länger als 600 nm werden von körpereigenen Chromophoren, insbesondere Hämoglobin und Melanin, weniger absorbiert und gestreut. Auf diese Weise kann rotes Licht durch mehrere Zentimeter Gewebe hindurch geleitet werden, so dass die Photonen die CCD-Kamera auch aus dem viszeralen Gewebe erreichenkönnen 39,40.
Ein Problembereich bei bildgebenden Verfahren ist das Fehlen eines umfassenden Verständnisses ihrer Funktion und Wirkungen. Binning, eine Vorverarbeitungstechnik, kombiniert die von zusammenhängenden Detektoren erfassten Informationen zu einem größeren Pixel. Dieser Prozess verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis, reduziert Hintergrundgeräusche und verbessert die Empfindlichkeit. Es verringert jedoch die Genauigkeit der räumlichen Auflösung, was zu einem pixeligen Bild führt41,42. Dieser Kompromiss ist ein wichtiger Aspekt in Ihrer Bildgebungsstrategie.
Basierend auf dem Target Product Profile und dem Target Candidate Profile for Chagasdisease 34 konzentriert sich die Proof-of-Concept-Studie auf die Sensitivität zum Nachweis von T. cruzi und hilft bei der Feststellung, ob ein neuer Wirkstoffkandidat eine sterile Heilung erreichen kann (dargestellt durch das Fehlen eines Rezidivs nach mehreren Immunsuppressionsrunden). Daher führen wir die BLI mit dem höchsten Binning-Faktor aus, ohne das Bild zu übersättigen. Wenn das Bild übersättigt ist, wird eine Neuaufnahme mit einem niedrigeren Binning-Faktor durchgeführt. Während der Analyse wird eine mathematische Korrektur auf die Bilder angewendet, die ein anderes Binning erforderten. Auf diese Weise sollten die endgültigen Daten mit dem gleichen Binning dargestellt werden. Tabelle 1 zeigt die unterschiedlichen Werte, die erhalten wurden, wenn unterschiedliche Binning-Faktoren im selben Bild und in denselben ROIs angewendet wurden.
Tabelle 1: Einfluss der Binning-Einstellungen auf die BLI-Quantifizierung. Quantifizierung von drei ROIs auf dem Bild des akuten Modells (d13) und des chronischen Modells (d118), analysiert in verschiedenen Binning-Faktoren. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Aufgrund des aktuellen Szenarios der Chagas-Krankheit in der Klinik zielen die Bemühungen zur Wirkstoffforschung darauf ab, Parasiten vollständig zu eliminieren (parasitologische Heilung)27,34. Daher enthält das präklinische In-vivo-Protokoll Ansätze, die die Grenzen der technischen Sensibilität von BLI überwinden. Einer der Ansätze besteht darin, die Mäuse mit Cyclophosphamid zu behandeln, um die Immunantwort zu verringern, die die Parasitenlast steuert. Eine andere Strategie besteht darin, die Gewebetiefe zu verringern und Schichten von Muskeln, Haut und Fell zu entfernen, die den Lichtweg zur Kamera behindern. Durch das ex vivo-Verfahren können kleine biolumineszierende Flecken nachgewiesen werden, die Parasitenherde unterhalb der in vivo BLI-Schwelle aufdecken, wie in Abbildung 5C im ex vivo-Ergebnis einer mit Posa behandelten Maus gezeigt.
Die Konzeption eines Pilotexperiments zur Evaluierung des Modells selbst und der Infektionsdynamik ist entscheidend für die Etablierung eines genauen Experiments zur Bewertung der Wirksamkeit von Antiparasitika. Auf diese Weise wird der Forscher in der Lage sein, die richtigen BLI-Einstellungen und den Verlauf des Infektionszeitpunkts im Voraus zu definieren. In einem explorativen Experiment ist die “Autoexposure” ein Werkzeug, das hilfreich sein kann, um die Aufnahmeeinstellungen zu definieren. Mit diesem Werkzeug legt der Forscher die Priorität von drei Einstellungen (Belichtungszeit, Binning und Blende) fest, um das bestmögliche Bild zu erhalten. Insbesondere sollte der Forscher darauf achten, dass die Bilder innerhalb des Dynamikbereichs der CCD-Kamera aufgenommen werden, ohne Übersättigung oder Unterbelichtung, was durch die minimalen und maximalen Grenzen der Skala und der Autoexposure-Funktion überprüft werden kann (Menü Bearbeiten > Einstellungen > Tab Aufnahme > Tab Autoexposure). In diesem Protokoll wurde die Kamerablende auf den Maximalwert (F/Stop: 1) eingestellt und unterschiedliche Belichtungszeiten und Binning-Faktoren für akute und chronische Modelle definiert. Diese Einstellungen ermöglichen eine zeitliche Vorhersagbarkeit, um verschiedene Bildrunden gleichzeitig durchzuführen. Da die Reportermethode auf einer enzymatischen Reaktion basiert, beeinflussen sowohl die Bioverteilung des Substrats in der Maus als auch die Luciferase-Kinetik das Biolumineszenzsignal und damit die Quantifizierung der Infektion (Abbildung 1B). Folglich führt die Aufnahme von Bildern zu verschiedenen Zeitpunkten der enzymatischen Kinetik zu einer Datenvariabilität, die nicht berücksichtigt oder korrigiert werden kann und sich auf die Berechnung des Gesamtflusses (Photonen/Sekunde) oder der Strahldichte (Photonen/Sekunde/cm2/Steradiant) auswirkt. Außerdem zeigt die T. cruzi-Infektion bei Mäusen eine dynamische räumliche Positionierung (verschiedene Bereiche und Gewebe, Tiefe und Parasitenlast). Daher könnte die Festlegung eines Wertes für die zu erfassende Anzahl schwächere Signalquellen (geringe Anzahl von Parasiten an einer bestimmten Stelle tiefer im Gewebe) übersehen, wenn die Quelle eines anderen stärkeren Signals die definierten Auto-Expositionskriterien erfüllt.
Eine knifflige Funktion der Living Image-Software ist die Anzeige des aufgenommenen Bildes in einer automatischen Farbskala. Es gibt keine Möglichkeit, die Skala so voreinzustellen, dass automatisch ein brandneu aufgenommenes Bild entsprechend den ausgewählten Skalenwerten angezeigt wird (siehe Protokollschritt 6.2). Diese Situation zwingt den Forscher, die Bilder manuell nacheinander auf die gewählten Maximal- und Minimalwerte zu ändern. Dies hat zur Folge, dass die unerfahrenen und nicht gut geschulten Benutzer während der Erfassungssitzung nicht über die richtige Anzeige verfügen und die Daten in die Irre führen oder zu diesem Zeitpunkt wichtige Informationen verlieren könnten. Dafür ist der Pilotversuch von Vorteil.
Eine der häufigsten Fragen zum Proof-of-Concept-Versuchsdesign ist die Wahl der Behandlungsdauer und -dosis. Bei neuen chemischen Wirkstoffen werden diese Parameter in der Regel durch die Wirksamkeit und Selektivität der Verbindung in vitro definiert, in Kombination mit Daten aus dem Arzneimittelmetabolismus und der Pharmakokinetik (DMPK) und Verträglichkeitsstudien, die vor der Prüfung der Wirksamkeit in vivo durchgeführt wurden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass nach der Identifizierung von Verbindungen, die in der Lage sind, den Parasiten in Zellen selektiv abzutöten, die ersten ADME-Experimente (Absorption, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung) in vitro durchgeführt werden, um unter anderem die wässrige Löslichkeit, die Zellpermeabilität und die metabolische Stabilität der Verbindungen abzuschätzen. Wenn die Verbindungen ein gutes Gleichgewicht der In-vitro-Eigenschaften aufweisen (die in der Regel in den Profilen der Zielkandidaten definiert sind), werden diese Kandidaten in vivo pharmakokinetischen (PK) Studien an gesunden Mäusen unterzogen, die die Exposition der Verbindung im Blut (und möglicherweise auch im Gewebe) beschreiben und eine allgemeine Vorstellung von der Verträglichkeit bei verschiedenen Dosierungen geben17. 34,43. Im Idealfall besteht das Ziel der PK-Bewertung bei den meisten Infektionskrankheiten darin, die Machbarkeit zu bestimmen, freie Plasmakonzentrationen (korrigiert um die Plasmaproteinbindung) zu erreichen, die über den EC50/EC90-Konzentrationen 44 liegen – der wirksamen Konzentration, die das Wachstum von 50 % bzw. 90 % der Parasiten abtötet oder zumindest hemmt – für einen ausreichend langen Zeitraum. Wenn bei einer bestimmten Dosis eine ausreichende Exposition erreicht wird, kann dieses Schema während der Wirksamkeitsstudien unter Verwendung des Chagas BLI-Modells angewendet werden. Für Studien zur Repositionierung von Arzneimitteln sollten In-vitro– und In-vivo-PK-Daten verfügbar sein. Ein guter Anfang für das Reprofiling von Medikamenten sind chemische Datenbanken wie PubChem45, die anerkannte Daten liefern, die mit Hilfe der allometrischen Skalierung46 auf Mäuse übertragen werden können, um sichere und nicht-toxische Behandlungsschemata abzuschätzen, die getestet werden sollen. Das ist jedoch nicht immer der Fall. PK-Studien sind in der akademischen Wissenschaft immer noch ein übersehenes Feld, und nur wenige Pharmaunternehmen veröffentlichen ihre PK-Ergebnisse. Die Fachwelt der Wirkstoffforschung empfiehlt, die In-vivo-PK-Bewertung zusammen mit Arzneimittelwirksamkeitstests (Pharmakodynamik) einzubeziehen47. Daher ist die präklinische Bildgebung mit gleichzeitigen Verbindungsmessungen kompatibel, und dieser damit verbundene Ansatz erhöht die Robustheit der Daten.
Darüber hinaus werden die Handhabung, das Gewicht und der Gesundheitszustand der Mäuse während des gesamten Experiments überwacht. Anzeichen von Toxizität und Nebenwirkungen wie Krümmen, Zittern, Gleichgewichtsverlust, Unwilligkeit, Fütterungs- oder Getränkeunlust, Erschöpfung oder andere Anomalien, die in der Gruppe oder bei einzelnen Mausbedingungen auftreten, sollten in präklinischen Studien registriert und berichtet werden. Eines der Ziele der optischen Bildgebung ist es, das Wohlbefinden der Tiere zu gewährleisten. Daher sollten humane Endpunkte bei Mäusen mit Schmerzsymptomen angewendet werden, die in der ‘Grimace-Skala48 beschrieben sind. Außerdem wurden die Mäuse wöchentlich während der BLI-Akquisition und häufiger während der Medikamentendosierung und der CTX-Behandlung gewogen. Gemäß den Tierschutzbestimmungen müssen Mäuse, die mehr als 20 % ihres Körpergewichts verlieren, sofort auf humane Weise eingeschläfert werden.
Das Biolumineszenzmodell von T. cruzi ist nun das hochmoderne experimentelle Modell für die Entdeckung und Entwicklung neuer Therapien für die Chagas-Krankheit. Ein Modell, das Schlüsselmerkmale der T. cruzi-Infektion und der Chagas-Krankheitrepliziert 49 und eine Echtzeitüberwachung von Parasitämie und die Differenzierung von Verbindungen mit unterschiedlichen Wirksamkeitsprofilen in Verbindung mit bekannten Wirkmechanismen ermöglicht. BLI ist eine Technik, die das Durchsetzungsvermögen bei der Identifizierung von infiziertem Gewebe verbessert. Es ermöglicht die präzise Selektion infizierter Gewebe, die in einem breiten Spektrum von Ansätzen eingesetzt werden können, einschließlich aller klassischen Methoden, die bereits in der T. cruzi-Forschung angewendet werden50,51. Darüber hinaus ermöglicht es Forschern, Spitzentechnologien zu erforschen und neue zu entwickeln33. Darüber hinaus sorgt BLI für eine Verbesserung des Wohlbefindens der Tiere und eine rationellere Verwendung gemäß den 3R-Prinzipien10,35, alles auf einmal.
Mehrere Forschungsgruppen, die sich mit vernachlässigten Tropenkrankheiten befassen, befinden sich in Ländern, in denen in vivo bildgebende Geräte nicht verfügbar sind. Um das derzeitige Szenario zu überwinden, fördern neue internationale Netzwerke wie Global BioImaging und die mit ihnen verbundenen Konsortien Maßnahmen, um einen offenen Zugang zu den Kerneinrichtungen der Bildgebung zu ermöglichen und die Ausbildung von Mitarbeitern und Bildgebungswissenschaftlern zu verbessern52,53. Diese Initiativen, zusammen mit benutzerfreundlichen Protokollen wie diesem, können Bedingungen schaffen, die High-End-Technologien für alle Forscher demokratisieren. Die Implementierung dieser Methode in der präklinischen Wirkstoffforschung bot eine solide Wirksamkeitsmessung und einen prädiktiven Wert des klinischen Ergebnisses, was die Wirkstoffforschung für die Chagas-Krankheit erleichtert.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken Amanda Franscisco, John Kelly und Fanny Escudié für die Bereitstellung von BLI-Schulungen und Unterstützung bei Wirksamkeitstests für Medikamente, John Kelly und Simone Calderano für die Bereitstellung von Parasiten und Gabriel Padilla für die Unterstützung bei Tierversuchen. A.C.S. erhielt ein CAPES PSDE-Stipendium für die Ausbildung an der London School of Hygiene and Tropical Medicine (Vereinigtes Königreich). Die Autoren danken auch der FLUIR-Plattform (Flow Cytometry and Imaging Research) an der Core Facility for Scientific Research – University of Sao Paulo (CEFAP-USP) für die technische Unterstützung bei der Analyse der IVIS-Spektrum-Geräte und dem Labor für Genetik und sanitäre Kontrolle ICB-USP für die Assays nach dem Experiment zur Qualitätskontrolle von Mäusen als spezifisch pathogenfrei. Dieses Projekt wurde vom DNDi gefördert. DNDi ist seinen öffentlichen und privaten Spendern dankbar, die seit seiner Gründung im Jahr 2003 alle DNDi-Aktivitäten finanziert haben. Eine vollständige Liste der Spender von DNDi finden Sie unter https://dndi.org/about/donors/.
BD LSRFortessa™ X-20 Cell Analyzer | BD Biosciences | ||
Weighing Balance (animal facility) | Available from several suppliers | ||
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Revvity (former PerkinElmer) | ||
FlowJ Software v10.7.1 | BD Biosciences | ||
Living Image Software for Spectrum v4.7.1 | Revvity (former PerkinElmer) | License Free Analysis Software called 'Aura Imaging' could be used for the most basic features provided by Spectral Instruments Imaging (Bruker company) (https://spectralinvivo.com/software/) | |
Microsoft Office software | Microsoft | ||
GraphPad Prism v8.4.0 | GraphPad Software Inc. | ||
DMEM Low Glucose | Vitrocell | D0025 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
Foetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Trypsin 0.5% EDTA | Gibco | 25300-062 | |
LIT medium | In house | ||
Hygromycin B (50 mg/mL) | Gibco | 10687010 | |
Grace′s Insect Medium | Sigma-Aldrich | G9771 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | |
IVISBrite d-luciferin potassium salt | Revvity (former PerkinElmer) | 122799 | Also could be used: VivoGlo Luciferin, in vivo grade (Promega/P1043); D-Luciferin, Monopotassium Salt (Thermo Scientific/88293) or PierceD-Luciferin, Monosodium* Salt (Thermo Scientific/88291); D-Luciferin, Potassium Salt (GoldBio/LUCK or eLUCK); D-Luciferin, Sodium* Salt (GoldBio/LUCNA or eLUCNA) *Sodium or potassium salt differences relies minimal chances on solubility, however do not affect in vivo performance. |
DPBS | Gibco | 21600-044 | |
Cyclophosphamide (CTX) | Sigma-Aldrich | C0768-5g | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879 | |
(Hydroxypropyl)methyl cellulose (HPMC) | Sigma-Aldrich | 09963-25G | |
Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | 402834 | |
Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754-1L | |
Benznidazole | ELEA | ||
Posaconazole (Noxafil commercial formulation) | Schering-Phough | ||
Giemsa | Available from several suppliers | ||
gavage needle (stainless-steel straight) – 22GA | Aton | CA2003 | |
1 mL Syringe and 31G needle | Available from several suppliers | ||
1 mL Syringe and removable 26G needle | Available from several suppliers | ||
1 mL Syringe and removable 24G X¾ needle | Available from several suppliers | ||
Sterile Syringe Filter 0.2 µm | Available from several suppliers | ||
A4 Matte Black paper 120gr or thicker | Paper Color/ Canson (Available from several suppliers) | ||
aluminum foil | Available from several suppliers | ||
Neubauer chamber | Available from several suppliers |
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