قياس إجهاد الشبكة الإندوبلازمية واستجابة البروتين المتكشف في الخلايا التائية المصابة بفيروس العوز المناعي البشري -1 وتحليل دورها في تكاثر فيروس العوز المناعي البشري -1
Summary
هنا ، نصف بعض الطرق المعمول بها لتحديد إجهاد الشبكة الإندوبلازمية (ER) وتنشيط استجابة البروتين غير المطوية (UPR) ، مع التركيز بشكل خاص على عدوى فيروس العوز المناعي البشري -1. تصف هذه المقالة أيضا مجموعة من البروتوكولات للتحقيق في تأثير إجهاد ER / الاستعراض الدوري الشامل على تكرار فيروس نقص المناعة البشرية -1 وعدوى الفيروسات.
Abstract
يمكن أن تسبب العدوى الفيروسية إجهاد الشبكة الإندوبلازمية (ER) بسبب تراكم البروتين غير الطبيعي ، مما يؤدي إلى استجابة البروتين غير المطوية (UPR). طورت الفيروسات استراتيجيات للتلاعب بالاستعراض الدوري الشامل المضيف ، ولكن هناك نقص في الفهم التفصيلي لتعديل الاستعراض الدوري الشامل وأهميته الوظيفية أثناء الإصابة بفيروس العوز المناعي البشري -1 في الأدبيات. في هذا السياق ، تصف المقالة الحالية البروتوكولات المستخدمة في مختبرنا لقياس مستويات إجهاد ER و UPR أثناء الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 في الخلايا التائية وتأثير الاستعراض الدوري الشامل على تكاثر الفيروس والعدوى.
تلطيخ Thioflavin T (ThT) هو طريقة جديدة نسبيا تستخدم للكشف عن إجهاد ER في الخلايا عن طريق الكشف عن مجاميع البروتين. هنا ، أوضحنا بروتوكول تلطيخ ThT في الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 للكشف عن إجهاد ER وقياسه. علاوة على ذلك ، تم الكشف عن إجهاد ER أيضا بشكل غير مباشر عن طريق قياس مستويات علامات الاستعراض الدوري الشامل مثل BiP و IRE1 المفسفرة و PERK و eIF2α وربط XBP1 وانقسام ATF6 و ATF4 و CHOP و GADD34 في الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 ، باستخدام النشاف المناعي التقليدي وتفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (RT-PCR). لقد وجدنا أن مضان ThT يرتبط بمؤشرات تنشيط الاستعراض الدوري الشامل. توضح هذه المقالة أيضا بروتوكولات تحليل تأثير إجهاد ER وتعديل الاستعراض الدوري الشامل على تكرار HIV-1 عن طريق تجارب ضربة قاضية وكذلك استخدام الجزيئات الدوائية. تم تحليل تأثير الاستعراض الدوري الشامل على التعبير الجيني / التكاثر الجيني لفيروس العوز المناعي البشري -1 وإنتاج الفيروس بواسطة فحوصات مراسل Luciferase والتقاط مستضد p24 ELISA ، على التوالي ، في حين تم تحليل التأثير على عدوى virion عن طريق تلطيخ خلايا المراسل المصابة. بشكل جماعي ، توفر هذه المجموعة من الأساليب فهما شاملا لمسارات استجابة البروتين غير المطوية أثناء الإصابة بفيروس العوز المناعي البشري -1 ، مما يكشف عن ديناميكياتها المعقدة.
Introduction
تتميز متلازمة نقص المناعة المكتسب (الإيدز) بانخفاض تدريجي في عدد الخلايا الليمفاوية التائية CD4 + ، مما يؤدي إلى الفشل التدريجي للاستجابة المناعية. فيروس نقص المناعة البشرية -1 (HIV-1) هو العامل المسبب للإيدز. إنه فيروس RNA مغلف ، إيجابي ، مفرد تقطعت به السبل مع نسختين من الحمض النووي الريبي لكل virion وينتمي إلى عائلة retroviridae. إن إنتاج تركيزات عالية من البروتينات الفيروسية داخل الخلية المضيفة يضع ضغطا مفرطا على آلية طي البروتين في الخلية1. ER هو المقصورة الأولى في المسار الإفرازي للخلايا حقيقية النواة. وهي مسؤولة عن إنتاج وتغيير وتوصيل البروتينات إلى المسار الإفرازي والمواقع المستهدفة الفضائية خارج الخلية. تخضع البروتينات للعديد من التغييرات بعد الترجمة وتطوى في شكلها الطبيعي في ER ، بما في ذلك الجليكوزيل المرتبط بالهليون وإنشاء روابط ثاني كبريتيد داخل الجزيئاتوبين الجزيئات 2. لذلك ، توجد تركيزات عالية من البروتينات في تجويف ER وهي عرضة جدا للتجميع والاختلال. تؤدي الحالات الفسيولوجية المختلفة ، مثل الصدمة الحرارية أو العدوى الميكروبية أو الفيروسية ، والتي تتطلب تخليقا محسنا للبروتين أو طفرة في البروتين ، إلى إجهاد ER بسبب زيادة تراكم البروتين في ER ، مما يزعج توازن تجويف ER. ينشط إجهاد ER شبكة من مسارات نقل الإشارات التكيفية المحفوظة للغاية ، استجابة البروتين غير المطوية (UPR) 3. يتم استخدام الاستعراض الدوري الشامل لإعادة الحالة الفسيولوجية الطبيعية للطوارئ من خلال مواءمة عبء البروتين غير المطوي وقدرته على الطي. يتم تحقيق ذلك عن طريق زيادة حجم ER والمرافقين الجزيئيين المقيمين في ER والطيات ، مما يؤدي إلى ارتفاع قدرة طي ER. يقلل الاستعراض الدوري الشامل أيضا من حمل البروتين في ER من خلال التوهين العالمي لتخليق البروتين على المستوى الانتقالي ويزيد من إزالة البروتينات غير المطوية من ER عن طريق تنظيم التحلل المرتبط ب ER (ERAD)4,5.
يتم استشعار إجهاد ER بواسطة ثلاثة بروتينات عبر غشائية مقيمة في ER: بروتين كيناز R (PKR) الشبيه بالشبكة الإندوبلازمية كيناز (PERK) ، وتنشيط عامل النسخ 6 (ATF6) ، والإنزيم الذي يتطلب الإينوزيتول من النوع 1 (IRE1). يتم الاحتفاظ بجميع هذه المستجيبات غير نشطة عن طريق الارتباط بعائلة بروتين الصدمة الحرارية Chaperone A (Hsp70) العضو 5 (HSPA5) ، المعروف أيضا باسم البروتين المرتبط (BiP) / 78-kDa البروتين المنظم للجلوكوز (GRP78). عند إجهاد ER وتراكم البروتينات غير المطوية / غير المطوية ، ينفصل HSPA5 ويؤدي إلى تنشيط هذه المستجيبات ، والتي تنشط بعد ذلك سلسلة من الأهداف النهائية التي تساعد في حل إجهاد ER ، وفي الظروف القاسية ، تعزز موت الخلايا6. عند الانفصال عن HSPA5 ، يتم تنشيط PERK autophosphorylates ، ونشاط الكيناز7. نشاط الكيناز يفسفر eIF2α ، مما يؤدي إلى التوهين الانتقالي ، مما يقلل من حمل البروتين في ER8. ومع ذلك ، في وجود عامل بدء الفوسفو حقيقي النواة 2α (eIF2α) ، تصبح إطارات القراءة المفتوحة غير المترجمة على mRNAs محددة مترجمة بشكل تفضيلي ، مثل ATF4 ، الذي ينظم الجينات التي يسببها الإجهاد. ATF4 و C / EBP البروتين المتماثل (CHOP) هي عوامل النسخ التي تنظم الجينات التي يسببها الإجهاد وتنظم موت الخلايا المبرمج ومسارات موت الخلايا 9,10. أحد أهداف ATF4 و CHOP هو توقف النمو والبروتين المسبب لتلف الحمض النووي (GADD34) ، والذي ، جنبا إلى جنب مع بروتين الفوسفاتيز 1 dephosphorylate peIF2α ويعمل كمنظم تغذية مرتدة للتوهين الانتقالي11. تحت ضغط ER ، ينفصل ATF6 عن HSPA5 ، وتتعرض إشارة توطين Golgi الخاصة به ، مما يؤدي إلى نقلها إلى جهاز Golgi. في جهاز جولجي ، يتم شق ATF6 بواسطة بروتياز الموقع 1 (S1P) وبروتياز الموقع 2 (S2P) لإطلاق الشكل المشقوق من ATF6 (ATF6 P50). ثم يتم نقل ATF6 p50 إلى النواة ، حيث يحفز التعبير عن الجينات المشاركة في طي البروتين ونضجه وإفرازه بالإضافة إلى تدهور البروتين12,13. أثناء إجهاد ER ، ينفصل IRE1 عن HSPA5 ، ومتعدد الميمرات ، والفسفرة التلقائية14. تنشط فسفرة IRE1 مجال RNase الخاص بها ، وتحديدا تتوسط في ربط 26 نيوكليوتيدات من الجزء المركزي من mRNA لبروتين ربط X-box 1 (XBP1) 15,16. هذا يولد نهاية C جديدة تمنح وظيفة التنشيط ، وتوليد بروتين XBP1s وظيفي ، وهو عامل نسخ قوي يتحكم في العديد من الجينات التي يسببها الإجهاد ER17,18. يعمل النشاط المشترك لعوامل النسخ هذه على تشغيل البرامج الجينية التي تهدف إلى استعادة توازن ER.
هناك طرق مختلفة للكشف عن إجهاد ER و UPR. وتشمل هذه الطرق التقليدية لتحليل علامات الاستعراض الدوري الشامل19,20. تشمل الطرق غير التقليدية المختلفة قياس حالة الأكسدة والاختزال للاستعراض الدوري الشامل وتوزيع الكالسيوم في تجويف ER بالإضافة إلى تقييم هيكل ER. يمكن استخدام المجهر الإلكتروني لمعرفة مدى تضخم تجويف ER استجابة لإجهاد ER في الخلايا والأنسجة. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تستغرق وقتا طويلا وتعتمد على توفر المجهر الإلكتروني ، والذي قد لا يكون متاحا لكل مجموعة بحثية. أيضا ، يعد قياس تدفق الكالسيوم وحالة الأكسدة والاختزال في ER أمرا صعبا بسبب توفر الكواشف. علاوة على ذلك ، فإن قراءات هذه التجارب حساسة للغاية وقد تتأثر بعوامل أخرى من التمثيل الغذائي الخلوي.
تتمثل إحدى التقنيات القوية والبسيطة لرصد مخرجات الاستعراض الدوري الشامل في قياس تنشيط مسارات الإشارات المختلفة للاستعراض الدوري الشامل وقد استخدمت لعقود في سيناريوهات إجهاد مختلفة. هذه الطرق التقليدية لقياس تفعيل الاستعراض الدوري الشامل اقتصادية ومجدية وتوفر المعلومات في وقت أقل مقارنة بالطرق الأخرى المعروفة. وتشمل هذه المناعية لقياس التعبير عن علامات الاستعراض الدوري الشامل على مستوى البروتين ، مثل فسفرة IRE1 و PERK و eIF2α وانقسام ATF6 عن طريق قياس شكل P50 من ATF6 وتعبير البروتين لعلامات أخرى مثل HSPA5 و XBP1 المقسم و ATF4 و CHOP و GADD34 بالإضافة إلى RT-PCR لتحديد مستويات mRNA وكذلك ربط XBP1 mRNA.
توضح هذه المقالة مجموعة من البروتوكولات التي تم التحقق من صحتها وموثوق بها لمراقبة إجهاد ER وتنشيط الاستعراض الدوري الشامل في الخلايا المصابة بفيروس HIV-1 ولتحديد الأهمية الوظيفية للاستعراض الدوري الشامل في تكرار HIV-1 والعدوى. تستخدم البروتوكولات الكواشف المتاحة بسهولة وكذلك الكواشف الاقتصادية وتوفر معلومات مقنعة حول مخرجات الاستعراض الدوري الشامل. إجهاد ER هو نتيجة لتراكم البروتينات غير المطوية / غير المطوية ، والتي تكون عرضة لتشكيل مجاميع البروتين21. نصف هنا طريقة للكشف عن تجمعات البروتين هذه في الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1. تلطيخ Thioflavin T هو طريقة جديدة نسبيا تستخدم للكشف عن هذه المجاميع البروتينية وقياسها22. وصف بيريولت وويرستوك هذه التقنية للكشف عن مجاميع البروتين وقياسها ، وبالتالي مستويات إجهاد ER في الخلايا الحية. لقد ثبت أن جزيء الفلورسنت الصغير ثيوفلافين T (ThT) يرتبط بشكل انتقائي بمجاميع البروتين ، وخاصة ألياف الأميلويد.
في هذه المقالة ، نصف استخدام ThT للكشف عن إجهاد ER وقياسه في الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 وربطه بالطريقة التقليدية لمراقبة الاستعراض الدوري الشامل عن طريق قياس تنشيط مسارات الإشارات المختلفة للاستعراض الدوري الشامل.
نظرا لوجود نقص في المعلومات الشاملة المتعلقة بدور الاستعراض الدوري الشامل أثناء الإصابة بفيروس العوز المناعي البشري -1 ، فإننا نقدم مجموعة من البروتوكولات لفهم دور الاستعراض الدوري الشامل في تكرار فيروس العوز المناعي البشري -1 وعدوى الفيروسات. تشمل هذه البروتوكولات ضربة قاضية بوساطة فيروس العدس لعلامات الاستعراض الدوري الشامل بالإضافة إلى العلاج بمحفزات الإجهاد ER الدوائية. توضح هذه المقالة أيضا أنواع القراءات التي يمكن استخدامها لقياس التعبير الجيني لفيروس نقص المناعة البشرية -1 ، والإنتاج الفيروسي بالإضافة إلى عدوى الفيروسات المنتجة ، مثل مقايسة لوسيفيراز القائمة على التكرار الطرفي الطويل (LTR) ، ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم p24 (ELISA) ومقايسة تلطيخ مراسل β جالون على التوالي.
باستخدام غالبية هذه البروتوكولات ، أبلغنا مؤخرا عن الآثار الوظيفية لعدوى فيروس العوز المناعي البشري -1 على الاستعراض الدوري الشامل في الخلاياالتائية 23 ، وتشير نتائج تلك المقالة إلى موثوقية الطرق الموضحة هنا. وبالتالي ، توفر هذه المقالة مجموعة من الطرق للحصول على معلومات شاملة بشأن تفاعل HIV-1 مع إجهاد ER وتنشيط الاستعراض الدوري الشامل.
Protocol
Representative Results
Discussion
يشمل نطاق هذا البروتوكول (i) التعامل مع مخزونات فيروس HIV-1 وقياس تركيز الفيروس وعدوى virion ، (ii) إصابة الخلايا التائية بفيروس HIV-1 وتقييم تأثيرها على إجهاد ER وعلامات مختلفة من الاستعراض الدوري الشامل ، (iii) تأثير ضربة قاضية لعلامات الاستعراض الدوري الشامل وتأثيرها على النشاط ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر المركز الوطني لعلوم الخلية ، قسم التكنولوجيا الحيوية ، حكومة الهند ، على الدعم الداخلي. AT و AD ممتنان للدكتوراه الدعم البحثي الذي تلقاه من المركز الوطني لعلوم الخلية ، قسم التكنولوجيا الحيوية ، حكومة الهند. DM ممتنة لزمالة JC Bose الوطنية من SERB ، حكومة الهند.
Materials
| Acrylamamide | Biorad, USA | 1610107 | |
| Agarose | G-Biosciences, USA | RC1013 | |
| Ammonium persulphate | Sigma-Aldrich, USA | A3678 | |
| anti-ATF4 antibody | Cell Signaling Technology, USA | 11815 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-ATF6 antibody | Abcam, UK | ab122897 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-CHOP antibody | Cell Signaling Technology, USA | 2897 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-eIF2α antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-11386 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
| anti-GADD34 antibody | Abcam, UK | ab236516 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-32233 | Western blot detection Dilution-1:3000 |
| anti-HSPA5 antibody | Cell Signaling Technology, USA | 3177 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-IRE1 antibody | Cell Signaling Technology, USA | 3294 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
| Anti-mouse HRP conjugate antibody | Biorad, USA | 1706516 | Western blot detection Dilution- 1:4000 |
| anti-peIF2α antibody | Invitrogen, USA | 44-728G | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-PERK antibody | Cell Signaling Technology, USA | 5683 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
| anti-pIRE1 antibody | Abcam, UK | ab243665 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-pPERK antibody | Invitrogen, USA | PA5-40294 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
| Anti-rabbit HRP conjugate antibody | Biorad, USA | 1706515 | Western blot detection Dilution- 1:4000 |
| anti-XBP1 antibody | Abcam, UK | ab37152 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| Bench top high speed centrifuge | Eppendorf, USA | 5804R | Rotor- F-45-30-11 |
| Bench top low speed centrifuge | Eppendorf, USA | 5702R | Rotor- A-4-38 |
| Bis-Acrylamide | Biorad, USA | 1610201 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MP biomedicals, USA | 160069 | |
| Bradford reagent | Biorad, USA | 5000006 | |
| CalPhos mammalian Transfection kit | Clontech, Takara Bio, USA | 631312 | Virus stock preparation |
| CEM-GFP | NIH, AIDS Repository, USA | 3655 | |
| Clarity ECL substrate | Biorad, USA | 1705061 | chemiluminescence detecting substrate |
| Clarity max ECL substrate | Biorad, USA | 1705062 | chemiluminescence detecting substrate |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus, Japan | Model:FV3000 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Fisher Scientific, USA | ASHA78300003 | |
| DMEM | Invitrogen, USA | 11995073 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich, USA | D2650 | |
| dNTPs | Promega, USA | U1515 | |
| DTT | Invitrogen, USA | R0861 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | 12635 | |
| EtBr | Invitrogen, USA | `15585011 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, USA | 16000044 | |
| G418 | Invitrogen, USA | 11811023 | |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich, USA | G6257 | Infectivity assay |
| Glycine | Thermo Fisher Scientific, USA | Q24755 | |
| HEK-293T | NCCS, India | ||
| HIV-1 infectious Molecular Clone pNL4-3 | NIH, AIDS Repository, USA | 114 | |
| Inverted microscope | Nikon, Japan | Model: Eclipse Ti2 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad, USA | 1715124 | |
| Jurkat J6 | NCCS, India | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich, USA | M8266 | Infectivity assay |
| MMLV-RT | Invitrogen, USA | 28025013 | |
| MTT reagent | Sigma-Aldrich, USA | M5655 | Cell viability assay |
| N,N-dimethyl formamide | Fluka Chemika | 40255 | Infectivity assay |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific, USA | Q27605 | |
| NaF | Sigma-Aldrich, USA | 201154 | |
| NP40 | Invitrogen, USA | 85124 | |
| P24 antigen capture ELISA kit | ABL, USA | 5421 | |
| PageRuler prestained protein ladder | Sci-fi Biologicals, India | PGPMT078 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, USA | P6148 | |
| pEGFP-N1 | Clontech, USA | 632515 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen, USA | 151140122 | |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich, USA | 4906837001 | |
| Phusion High-fidelity PCR mastermix with GC buffer | NEB,USA | M05532 | |
| pLKO.1-TRC | Addgene, USA | 10878 | Lentiviral cloning vector |
| pMD2.G | Addgene, USA | 12259 | VSV-G envelope vector |
| PMSF | Sigma-Aldrich, USA | P7626 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences, Inc., USA | 23966 | |
| Potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich, USA | 244023 | Infectivity assay |
| Potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich, USA | P3289 | Infectivity assay |
| Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich, USA | 5056489001 | |
| psPAX2 | Addgene, USA | 12260 | Lentiviral packaging plasmid |
| Puromycin | Sigma-Aldrich, USA | P8833 | Selection of stable cells |
| PVDF membrane | Biorad, USA | 1620177 | |
| Random primers | Invitrogen, USA | 48190011 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen, USA | 22400105 | |
| SDS | Sigma-Aldrich, USA | L3771 | |
| Steady-Glo substrate | Promega, USA | E2510 | Luciferase assay |
| T4 DNA ligase | Invitrogen, USA | 15224017 | |
| TEMED | Invitrogen, USA | 17919 | |
| Thapsigargin | Sigma-Aldrich, USA | T9033 | |
| Thioflavin T | Sigma-Aldrich, USA | 596200 | |
| Tris | Thermo Fisher Scientific, USA | Q15965 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, USA | T8787 | |
| Trizol | Invitrogen, USA | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, USA | P1379 | |
| TZM-bl | NIH, AIDS Repository, USA | 8129 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Optima L90K, USA | 330049 | Rotor-SW28Ti |
| UltraPure X-gal | Invitrogen, USA | 15520-018 | Infectivity assay |
References
- Levy, J. A. . HIV and the Pathogenesis of AIDS. , (2007).
- Hebert, D. N., Molinari, M. In and out of the ER: Protein folding, quality control, degradation, and related human diseases. Physiol Rev. 87 (4), 1377-1408 (2007).
- Mori, K. The unfolded protein response: The dawn of a new field. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 91 (9), 469-480 (2015).
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
- Kaufman, R. J. Orchestrating the unfolded protein response in health and disease. J Clin Invest. 110 (10), 1389-1398 (2002).
- Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 519-529 (2007).
- Marciniak, S. J., Garcia-Bonilla, L., Hu, J., Harding, H. P., Ron, D. Activation-dependent substrate recruitment by the eukaryotic translation initiation factor 2 kinase PERK. J Cell Biol. 172 (2), 201-209 (2006).
- Harding, H. P., Zhang, Y., Ron, D. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature. 397 (6716), 271-274 (1999).
- Vattem, K. M., Wek, R. C. Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (31), 11269-11274 (2004).
- Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell. 11 (3), 619-633 (2003).
- Novoa, I., Zeng, H., Harding, H. P., Ron, D. Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2α. J Cell Biol. 153 (5), 1011-1021 (2001).
- Haze, K., Yoshida, H., Yanagi, H., Yura, T., Mori, K. Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress. Mol Biol Cell. 10 (11), 3787-3799 (1999).
- Ye, J., et al. ER stress induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs. Mol Cell. 6 (6), 1355-1364 (2000).
- Tirasophon, W., Welihinda, A. A., Kaufman, R. J. A stress response pathway from the endoplasmic reticulum to the nucleus requires a novel bifunctional protein kinase/endoribonuclease (Ire1p) in mammalian cells. Genes Dev. 12 (12), 1812-1824 (1998).
- Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
- Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
- Wu, J., et al. ATF6α optimizes long-term endoplasmic reticulum function to protect cells from chronic stress. Dev Cell. 13 (3), 351-364 (2007).
- Shoulders, M. D., et al. Stress-independent activation of XBP1s and/or ATF6 reveals three functionally diverse ER proteostasis environments. Cell Rep. 3 (4), 1279-1292 (2013).
- Oslowski, C. M., Urano, F. Measuring ER stress and the unfolded protein response using mammalian tissue culture system. Methods Enzymol. 490, 71-92 (2011).
- Gupta, S., Samali, A., Fitzgerald, U., Deegan, S. Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response. Int J Cell Biol. 2010, 830307 (2010).
- Wang, M., Kaufman, R. J. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease. Nature. 529 (7586), 326-335 (2016).
- Beriault, D. R., Werstuck, G. H. Detection and quantification of endoplasmic reticulum stress in living cells using the fluorescent compound, Thioflavin T. Biochim Biophys Acta. 1833 (10), 2293-2301 (2013).
- Tripathi, A., Iyer, K., Mitra, D. HIV-1 replication requires optimal activation of the unfolded protein response. FEBS Lett. 597 (23), 2908-2930 (2023).
- Platt, E. J., Wehrly, K., Kuhmann, S. E., Chesebro, B., Kabat, D. Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 72 (4), 2855 (1998).
- Gervaix, A., West, D., Leoni, L. M., Richman, D. D., Wong-Staal, F., Corbeil, J. A new reporter cell line to monitor HIV infection and drug susceptibility in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4653-4658 (1997).
- Augustine, T., et al. Cyclin F/FBXO1 interacts with HIV-1 viral infectivity factor (Vif) and restricts progeny virion infectivity by ubiquitination and proteasomal degradation of vif protein through SCFcyclin F E3 ligase machinery. J Biol Chem. 292 (13), 5349-5363 (2017).
- Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916 (2021).
- Treiman, M., Caspersen, C., Christensen, S. B. A tool coming of age: Thapsigargin as an inhibitor of sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases. Trends Pharmacol Sci. 19 (4), 131-135 (1998).
- Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
- Sodroski, J., Rosen, C., Goh, W. C., Haseltine, W. A Transcriptional activator protein encoded by the x-lor region of the human T-cell leukemia virus. Science. 228 (4706), 1430-1434 (1985).
- Rosen, C. A., Sodroski, J. G., Kettman, R., Haseltine, W. A. Activation of enhancer sequences in type II human T-cell leukemia virus and bovine leukemia virus long terminal repeats by virus-associated trans-acting regulatory factors. J Virol. 57 (3), 738-744 (1986).
- Dandekar, D. H., Kumar, M., Ladha, J. S., Ganesh, K. N., Mitra, D. A quantitative method for normalization of transfection efficiency using enhanced green fluorescent protein. Anal Biochem. 342 (2), 341-344 (2005).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
- Peña, J., Harris, E. Dengue virus modulates the unfolded protein response in a time-dependent manner. J Biol Chem. 286 (16), 14226-14236 (2011).
- Soboleski, M. R., Oaks, J., Halford, W. P. Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells. FASEB J. 19 (3), 440-442 (2005).
- Martinez, Z. S., Castro, E., Seong, C. S., Cerón, M. R., Echegoyen, L., Llano, M. Fullerene derivatives strongly inhibit HIV-1 replication by affecting virus maturation without impairing protease activity. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5731-5741 (2016).
- Askari, S., Javadpour, P., Rashidi, F. S., Dargahi, L., Kashfi, K., Ghasemi, R. Behavioral and molecular effects of Thapsigargin-induced brain ER- stress: Encompassing inflammation, MAPK, and insulin signaling pathway. Life. 12 (9), 1374 (2022).
- Jaskulska, A., Janecka, A. E., Gach-Janczak, K. Thapsigargin-from traditional medicine to anticancer drug. Int J Mol Sci. 22 (1), 4 (2021).
- Shaban, M. S., et al. Multi-level inhibition of coronavirus replication by chemical ER stress. Nat Commun. 12 (1), 5536 (2021).
- Marciniak, S. J., Chambers, J. E., Ron, D. Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress in disease. Nat Rev Drug Discov. 21 (2), 115-140 (2022).
- Sriburi, R., Jackowski, S., Mori, K., Brewer, J. W. XBP1: A link between the unfolded protein response, lipid biosynthesis, and biogenesis of the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 167 (1), 35-41 (2004).
- Siwecka, N., Rozpędek-Kamińska, W., Wawrzynkiewicz, A., Pytel, D., Diehl, J. A., Majsterek, I. The structure, activation and signaling of IRE1 and its role in determining cell fate. Biomedicines. 9 (2), 156 (2021).
