Summary

Modelo de ratón modificado de lesión cerebral traumática leve repetitiva que incorpora ventana de cráneo adelgazada y percusión de fluidos

Published: April 19, 2024
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Summary

Este protocolo presenta un modelo murino modificado de lesión cerebral traumática leve repetitiva (rmTBI) inducida a través de un método de lesión craneal cerrada (CHI). El enfoque presenta una ventana de cráneo adelgazada y percusión de fluidos para reducir la inflamación comúnmente causada por la exposición a las meninges, junto con una mejor reproducibilidad y precisión en el modelado de rmTBI en roedores.

Abstract

El traumatismo craneoencefálico leve es un trastorno neurológico clínicamente muy heterogéneo. Se necesitan urgentemente modelos animales de lesiones cerebrales traumáticas (TCE) altamente reproducibles con patologías bien definidas para estudiar los mecanismos de la neuropatología después de un TCE leve y probar terapias. Replicar todas las secuelas del TCE en modelos animales ha demostrado ser un desafío. Por lo tanto, es necesaria la disponibilidad de múltiples modelos animales de TCE para dar cuenta de los diversos aspectos y severidades observados en los pacientes con TCE. CHI es uno de los métodos más comunes para fabricar modelos de roedores de rmTBI. Sin embargo, este método es susceptible a muchos factores, incluido el método de impacto utilizado, el grosor y la forma del hueso del cráneo, la apnea animal y el tipo de soporte e inmovilización de la cabeza utilizados. El objetivo de este protocolo es demostrar una combinación de los métodos de ventana de cráneo adelgazado y lesión por percusión fluida (FPI) para producir un modelo de ratón preciso de rmTBI asociado a CHI. El objetivo principal de este protocolo es minimizar los factores que podrían afectar la precisión y la consistencia del modelado de CHI y FPI, incluido el grosor del hueso del cráneo, la forma y el soporte de la cabeza. Al utilizar un método de ventana de cráneo adelgazado, se minimiza la inflamación potencial debido a la craneotomía y la FPI, lo que da como resultado un modelo de ratón mejorado que replica las características clínicas observadas en pacientes con TCE leve. Los resultados del análisis conductual e histológico utilizando la tinción de hematoxilina y eosina (HE) sugieren que el RMTBI puede conducir a una lesión acumulativa que produce cambios tanto en el comportamiento como en la morfología macroscópica del cerebro. En general, el rmTBI modificado asociado a CHI presenta una herramienta útil para que los investigadores exploren los mecanismos subyacentes que contribuyen a los cambios fisiopatológicos focales y difusos en el rmTBI.

Introduction

Las lesiones cerebrales traumáticas leves, incluidas las conmociones cerebrales y las subconmociones cerebrales, representan la mayoría de todos los casos de lesiones cerebrales traumáticas (>80% de todas las lesiones cerebrales traumáticas)1. Las lesiones cerebrales traumáticas leves suelen ser el resultado de caídas, accidentes de tráfico, actos de violencia, deportes de contacto (p. ej., fútbol, boxeo, hockey) y combates militares 2,3. El TCE leve puede provocar eventos neurobiológicos que afectan las funciones neuroconductuales a lo largo de la vida del paciente y aumentan el riesgo de enfermedades neurodegenerativas 4,5,6. Los modelos animales proporcionan un medio eficaz y controlado para estudiar el TCE leve, con la esperanza de mejorar aún más el diagnóstico y el tratamiento del TCE leve. Se han desarrollado varios modelos para el TCE leve, como el impacto cortical controlado (CCI), la caída de peso (WD), la lesión por percusión líquida (FPI) y los modelos de TBI por explosión 7,8. Ningún modelo experimental puede imitar toda la complejidad de la patología inducida por TCE 9,10. La heterogeneidad de estos modelos es ventajosa para abordar las diversas características asociadas con los pacientes con TCE leve e investigar los mecanismos celulares y moleculares correspondientes. Sin embargo, cada modelo animal de TCE tiene sus limitaciones3, lo que limita nuestro conocimiento actual sobre el TCE leve en animales y su relevancia clínica.

Los modelos WD y CCI se utilizan para replicar condiciones clínicas como pérdida de tejido cerebral, hematoma subdural agudo, lesión axonal, conmoción cerebral, disfunción de la barrera hematoencefálica e incluso coma después de un TCE 3,11,12. El modelo WD consiste en inducir daño cerebral al golpear la duramadre o el cráneo con pesos que caen libremente. El impacto de un objeto pesado sobre un cráneo intacto puede replicar lesiones mixtas focales/difusas; Sin embargo, este método se asocia con poca precisión y repetibilidad del sitio de la lesión, lesión de rebote y una mayor tasa de mortalidad por fracturas de cráneo 3,11,12. El modelo CCI consiste en aplicar metal accionado por aire para impactar directamente la duramadre expuesta. En comparación con el modelo WD, el modelo CCI es más preciso y reproducible, pero no produce lesiones difusas debido al pequeño diámetro de la punta impactadora11. Durante el modelado FPI, el tejido cerebral se desplaza brevemente y se deforma por percusión. La FPI puede inducir una lesión mixta focal/difusa y replicar la hemorragia intracraneal, la hinchazón del cerebro y el daño progresivo de la materia gris después de un traumatismo craneal. Sin embargo, la FPI tiene una alta tasa de mortalidad debido al daño del tronco encefálico y a la apnea prolongada 3,12. La craneotomía involucrada en los modelos convencionales de WD, CCI y FPI puede conducir a contusión cortical, lesiones hemorrágicas, daño de la barrera hematoencefálica, infiltración de células inmunitarias, activación de células gliales, tiempo de modelado prolongado y posibles resultados fatales 3,12.

El TCE leve se caracteriza por una puntuación GCS (escala de coma de Glasgow, GCS) dentro del rango de 13 a 152. El TCE leve puede ser focal o difuso y se asocia tanto con lesiones agudas, como la ruptura de la homeostasis celular, excitotoxicidad, depleción de glucosa, disfunción mitocondrial, alteración del flujo sanguíneo y daño axonal, como con lesiones subagudas, como daño axonal, neuroinflamación y gliosis 2,3. A pesar de los avances significativos en la delineación de la compleja fisiopatología del TCE, los mecanismos subyacentes del TCE/TCE leve siguen siendo difíciles de alcanzar y requieren más investigación9. Dado que el CHI es el tipo más común de TCE12, este protocolo presenta un enfoque novedoso para crear un modelo de ratón controlado con mayor precisión de la LCTM rm utilizando un dispositivo FPI modificado para realizar el impacto en una ventana de cráneo adelgazado13. Al evitar las lesiones inducidas por la craneotomía, el grosor variable del cráneo y las imprecisiones inducidas por la forma, así como las lesiones de rebote, este enfoque pretende superar las principales desventajas asociadas con los modelos WD, CCI y FPI. La aplicación del impacto de la FPI en la ventana del cráneo adelgazada es conveniente para evaluar el daño de los vasos cerebrales después de la RMT-TBI y ayuda a minimizar las altas tasas de mortalidad en algunos modelos, lo que resulta en una mayor semejanza con las características clínicas de los pacientes con TBI.

Protocol

Todos los procedimientos involucrados en este protocolo se realizaron bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Universidad Normal de Zhejiang, Número de Permiso, dw2019005) y en cumplimiento con el ARRIVE y la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Las especificaciones técnicas se pueden encontrar en la Tabla de Materiales. 1. Procedimiento de manipulación de animales Los ratones de ca…

Representative Results

El protocolo descrito en este estudio describe un método para inducir RMTBI a través de una ventana de cráneo adelgazada, que ofrece una solución a la lesión cerebral causada por la preparación de la craneotomía durante el modelado convencional de TBI por percusión. Al utilizar este procedimiento de percusión de fluido modificado con el dispositivo modificado, se logró una mayor precisión y reproducibilidad del impacto de FPI13. El impactador modificado tiene la versatilidad para ser ut…

Discussion

El traumatismo craneoencefálico se refiere a dos tipos principales, el cerrado y el penetrante, este último caracterizado por una alteración del cráneo y la duramadre. Los datos clínicos sugieren que las CHI son más prevalentes que las lesiones penetrantes 1,2. Después de un solo TCE leve, la mayoría de los pacientes experimentan síntomas de PCS que generalmente se resuelven en un corto período de tiempo, y existe controversia con respecto a la proporci…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación de Desarrollo Social Clave del Municipio de Jinhua (No. 2020-3-071), el Programa de Capacitación en Innovación y Emprendimiento de Estudiantes del Colegio de Zhejiang (No: S202310345087, S202310345088) y el Proyecto del Plan de Actividades de Innovación Científica y Tecnológica de los Estudiantes del Colegio Provincial de Zhejiang (2023R404044). Los autores agradecen a la señorita Emma Ouyang (estudiante de primer año de la Universidad Johns Hopkins, Bachelor of Science, Baltimore, EE.UU.) por la edición lingüística del artículo.

Materials

75% ethanol  Shandong XieKang Medical Technology Co., Ltd.  220502
Buprenorphine hydrochloride Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd H12020272 Solution, Analgesic
Carprofen Shanghai Guchen Biotechnology Co., Ltd 53716-49-7 Powder, Analgesic
Chlorhexidine digluconate Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd. 18472-51-0 19%-21% aqueous solution, Antimicrobial
Dental cement and solvent kit Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. 20220405, 3# Powder reconsituted in matching solvent
Dissecting microscope Shenzhen RWD Life Science Inc. 77019
Erythromycin ointment  Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd. 220412 Antibiotic
Fiber Optic Cold Light Source Shenzhen RWD Life Science Inc. F-150C
Flat-tipped micro-drill bit  Shenzhen RWD Life Science Inc. HM31008 2 mm, steel
FPI device software Jiaxing Bocom Biotech Inc. Biocom Animal Brain Impactor V1.0
ICR mice Jinhua Laboratory Animal Center   Stock#2023091 25 Male mice, 25-30g, 8 weeks old
Isoflurane Shandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd.  2023090501
Isothermal heating pad  Wenzhou Repshop Pet Products Co., Ltd. 
Luer Loc hup Custom made using a 19G needle hub
Micro hand-held skull drill Shenzhen RWD Life Science Inc. 78001 Max: 38,000rpm
Modified FPI device Jiaxing Bocom Biotech Inc.
Morris water maze Shenzhen RWD Life Science Inc. 63031 Evaluate mouse spatial learning and memory abilities
Open field Shenzhen RWD Life Science Inc. 63008 Evaluate mouse locomoation and anxiety
Ophthalmic lubricant  Suzhou Tianlong Pharmaceutical Co., Ltd.  SC230724B
Sodium diclofenac ointment  Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd. 221207 nonsteroidal anti-inflammatory drug
Small animal anesthesia system-Enhanced  Shenzhen RWD Life Science Inc. R530IP
Smart video-tracking system Panlab Harvard Apparatus Inc., MA, USA V3.0 Animal tracking and analysis
Stereotactic frame  Shenzhen RWD Life Science Inc. 68043
Vetbond Tissue Adhesive 3M, St Paul, MN, USA 202402AX Suture the animal wound
Y maze Shenzhen RWD Life Science Inc. 63005 Evaluate mouse spatial working memory

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Liu, Y., Mao, H., Chen, S., Wang, J., Ouyang, W. Modified Mouse Model of Repetitive Mild Traumatic Brain Injury Incorporating Thinned-Skull Window and Fluid Percussion. J. Vis. Exp. (206), e66440, doi:10.3791/66440 (2024).

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