Summary

間伐頭蓋窓と流体パーカッションを組み込んだ反復性軽度外傷性脳損傷の改良マウスモデル

Published: April 19, 2024
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Summary

このプロトコルは、反復性軽度外傷性脳損傷 (rmTBI) の修正マウス モデルを示しています 閉鎖性頭部損傷 (CHI) 法によって誘発されます。このアプローチは、髄膜曝露によって一般的に引き起こされる炎症を軽減するための薄くなった頭蓋骨窓と流体パーカッションを特徴としており、げっ歯類のrmTBIのモデリングにおける再現性と精度が向上しています。

Abstract

軽度の外傷性脳損傷は、臨床的に非常に不均一な神経障害です。軽度のTBI後の神経病理学のメカニズムを研究し、治療法をテストするためには、明確に定義された病状を持つ再現性の高い外傷性脳損傷(TBI)動物モデルが緊急に必要とされています。TBIの後遺症全体を動物モデルで再現することは、困難であることが証明されています。したがって、TBI患者に見られる多様な側面と重症度を説明するためには、TBIの複数の動物モデルの利用可能性が必要です。CHI は、rmTBI のげっ歯類モデルを作製するための最も一般的な方法の 1 つです。ただし、この方法は、使用される衝撃方法、頭蓋骨の厚さと形状、動物の無呼吸、使用される頭部サポートと固定の種類など、多くの要因の影響を受けやすいです。このプロトコルの目的は、薄くなった頭蓋骨窓と流体打楽器損傷 (FPI) 法の組み合わせを実証して、CHI 関連 rmTBI の正確なマウス モデルを作成することです。このプロトコルの主な目的は、頭蓋骨の厚さ、形状、頭部のサポートなど、CHIおよびFPIモデリングの精度と一貫性に影響を与える可能性のある要因を最小限に抑えることです。頭蓋骨窓間伐法を利用することにより、開頭術とFPIによる潜在的な炎症が最小限に抑えられ、軽度のTBI患者に観察された臨床的特徴を再現する改良されたマウスモデルが得られます。ヘマトキシリンとエオシン(HE)染色を用いた行動および組織学的解析の結果は、rmTBIが脳の行動と肉眼的形態の両方に変化をもたらす累積的な損傷を引き起こす可能性があることを示唆しています。全体として、修飾された CHI 関連 rmTBI は、研究者が rmTBI の限局性およびびまん性病態生理学的変化に寄与する根本的なメカニズムを調査するための有用なツールを提供します。

Introduction

脳震盪および脳震盪を含む軽度の脳外傷は、すべての脳外傷症例の大部分を占めています (全脳震盪の>80%)1。軽度のTBIは、通常、転倒、交通事故、暴力行為、コンタクトスポーツ(サッカー、ボクシング、ホッケーなど)、および軍事戦闘から生じます2,3。軽度のTBIは、患者の生涯を通じて神経行動機能に影響を及ぼし、神経変性疾患のリスクを高める神経生物学的イベントを引き起こす可能性があります4,5,6。動物モデルは、軽度TBIを研究するための効率的で制御された手段を提供し、軽度TBIの診断と治療をさらに強化することを期待しています。制御皮質衝撃 (CCI)、ウェイト ドロップ (WD)、流体パーカッション損傷 (FPI)、ブラスト TBI モデル 7,8 など、軽度の TBI のさまざまなモデルが開発されています。単一の実験モデルで、TBI誘発性病理学の全複雑性を模倣することはできません9,10。これらのモデルの不均一性は、軽度のTBI患者に関連する多様な特徴に対処し、対応する細胞および分子メカニズムを調査するのに有利です。ただし、TBIの各動物モデルには限界があり3、動物の軽度のTBIとその臨床的関連性に関する現在の知識は限られています。

WDおよびCCIモデルは、脳組織の喪失、急性硬膜下血腫、軸索損傷、脳震盪、血液脳関門機能障害、さらにはTBI 3,11,12後の昏睡などの臨床状態を再現するために使用されます。WDモデルは、硬膜または頭蓋骨のいずれかを自由に落下させる重りで打つことにより、脳の損傷を誘発することを含みます。無傷の頭蓋骨に加重された物体が衝撃を与えると、病巣性/びまん性が混在する損傷が再現される可能性があります。しかしながら、この方法は、損傷部位の精度および再現性の低下、リバウンド損傷、および頭蓋骨骨折による死亡率の上昇と関連している3,11,12。CCIモデルでは、空気駆動の金属を適用して、露出した硬膜に直接衝撃を与えます。WDモデルと比較して、CCIモデルはより正確で再現性がありますが、衝撃チップ11の直径が小さいため、びまん性損傷は発生しません。FPIモデリング中、脳組織はパーカッションによって一時的に変位し、変形します。FPI は、外傷後に混合限局性/びまん性損傷を誘発し、頭蓋内出血、脳の腫れ、進行性の灰白質損傷を再現する可能性があります。ただし、FPI は、脳幹の損傷と長期の無呼吸により死亡率が高くなります 3,12。従来の WD、CCI、FPI モデルに含まれる開頭術は、皮質挫傷、出血性病変、血液脳関門の損傷、免疫細胞の浸潤、グリア細胞の活性化、モデリング時間の延長、および致命的な結果につながる可能性があります 3,12

軽度のTBIは、GCS(グラスゴー昏睡尺度、GCS)スコアが13〜152の範囲にあることを特徴としています。軽度のTBIは、限局性またはびまん性のいずれかであり、細胞恒常性の破壊、興奮毒性、グルコース枯渇、ミトコンドリア機能障害、血流障害、軸索損傷などの急性損傷と、軸索損傷、神経炎症、神経膠症などの亜急性損傷の両方に関連しています2,3。TBIの複雑な病態生理学の描写における大きな進歩にもかかわらず、軽度のTBI / rmTBIの根底にあるメカニズムは依然としてとらえどころがなく、さらなる調査が必要です9。CHIがTBIの最も一般的なタイプであることを考えると12、このプロトコルは、薄くなった頭蓋骨窓13に衝撃を与えるために修正されたFPIデバイスを使用して、rmTBIのより正確に制御されたマウスモデルを作成するための新しいアプローチを提示する。開頭術による損傷、頭蓋骨の厚さの変動、形状による不正確さ、リバウンド損傷を回避することにより、このアプローチは、WD、CCI、およびFPIモデルに関連する主な欠点を克服することを目的としています。薄くなった頭蓋骨窓にFPIインパクトを適用すると、rmTBI後の脳血管損傷を評価するのに便利であり、一部のモデルで高い死亡率を最小限に抑えるのに役立ち、TBI患者の臨床的特徴により類似しています。

Protocol

このプロトコルに関連するすべての手順は、Institutional Animal Care and Use Committee(浙江師範大学、許可番号、dw2019005)の承認の下で、ARRIVEおよびNIHの実験動物のケアと使用に関するガイドに準拠して実施されました。技術仕様は 、資料表に記載されています。 1.動物の取り扱い手順 温度22-24°C、湿度40%-60%の範囲、12時間の明暗サイクルで制御さ…

Representative Results

この研究で説明されているプロトコルは、細くなった頭蓋骨窓を介して rmTBI を誘導する方法を概説しており、従来のパーカッション TBI モデリング中の開頭術の準備によって引き起こされる脳損傷に対する解決策を提供します。この変更された流体パーカッション手順を変更されたデバイスで利用することにより、FPI衝撃の精度と再現性が向上しました13。変更されたイン?…

Discussion

TBIは、閉鎖型と貫通型の2つの主要なタイプを指し、後者は頭蓋骨と硬膜の破壊を特徴としています。臨床データは、CHIが穿通性損傷よりも一般的であることを示唆しています1,2。軽度のTBIが1回あると、ほとんどの患者はPCSの症状を経験しますが、通常は短期間で解消し、PCSが長期後遺症に発展する患者の割合については論争があります<sup class="xre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作業は、金華市の主要な社会開発基金会(No.2020-3-071)、浙江大学生イノベーションおよび起業家精神トレーニングプログラム(No:S202310345087、S202310345088)、および浙江省大学学生の科学技術イノベーション活動計画プロジェクト(2023R404044)の支援を受けました。著者は、記事の言語編集に協力してくれたEmma Ouyang氏(ジョンズ・ホプキンス大学1年生、米国ボルチモアの理学士)に感謝します。

Materials

75% ethanol  Shandong XieKang Medical Technology Co., Ltd.  220502
Buprenorphine hydrochloride Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd H12020272 Solution, Analgesic
Carprofen Shanghai Guchen Biotechnology Co., Ltd 53716-49-7 Powder, Analgesic
Chlorhexidine digluconate Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd. 18472-51-0 19%-21% aqueous solution, Antimicrobial
Dental cement and solvent kit Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. 20220405, 3# Powder reconsituted in matching solvent
Dissecting microscope Shenzhen RWD Life Science Inc. 77019
Erythromycin ointment  Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd. 220412 Antibiotic
Fiber Optic Cold Light Source Shenzhen RWD Life Science Inc. F-150C
Flat-tipped micro-drill bit  Shenzhen RWD Life Science Inc. HM31008 2 mm, steel
FPI device software Jiaxing Bocom Biotech Inc. Biocom Animal Brain Impactor V1.0
ICR mice Jinhua Laboratory Animal Center   Stock#2023091 25 Male mice, 25-30g, 8 weeks old
Isoflurane Shandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd.  2023090501
Isothermal heating pad  Wenzhou Repshop Pet Products Co., Ltd. 
Luer Loc hup Custom made using a 19G needle hub
Micro hand-held skull drill Shenzhen RWD Life Science Inc. 78001 Max: 38,000rpm
Modified FPI device Jiaxing Bocom Biotech Inc.
Morris water maze Shenzhen RWD Life Science Inc. 63031 Evaluate mouse spatial learning and memory abilities
Open field Shenzhen RWD Life Science Inc. 63008 Evaluate mouse locomoation and anxiety
Ophthalmic lubricant  Suzhou Tianlong Pharmaceutical Co., Ltd.  SC230724B
Sodium diclofenac ointment  Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd. 221207 nonsteroidal anti-inflammatory drug
Small animal anesthesia system-Enhanced  Shenzhen RWD Life Science Inc. R530IP
Smart video-tracking system Panlab Harvard Apparatus Inc., MA, USA V3.0 Animal tracking and analysis
Stereotactic frame  Shenzhen RWD Life Science Inc. 68043
Vetbond Tissue Adhesive 3M, St Paul, MN, USA 202402AX Suture the animal wound
Y maze Shenzhen RWD Life Science Inc. 63005 Evaluate mouse spatial working memory

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Liu, Y., Mao, H., Chen, S., Wang, J., Ouyang, W. Modified Mouse Model of Repetitive Mild Traumatic Brain Injury Incorporating Thinned-Skull Window and Fluid Percussion. J. Vis. Exp. (206), e66440, doi:10.3791/66440 (2024).

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