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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

गतिशील ग्लाइकोसोमल पीएच को मापना: लिविंग ट्रिपैनोसोमा ब्रुसी में परिवर्तन

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/66279
Automatic Translation
*1, *2,3, 1, 2,3, 2,4, 1, 2
1Department Chemistry and Biochemistry, Brigham Young University, 2Eukaryotic Pathogens Innovation Center, Clemson University, 3Department of Genetics and Biochemistry, Clemson University, 4Department of Physics and Astronomy, Clemson University
* These authors contributed equally

Summary

हम अध्ययन करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं कि पीएच अफ्रीकी ट्रिपैनोसोम के रक्तप्रवाह रूप के ग्लाइकोसोम में पर्यावरणीय संकेतों का जवाब कैसे देता है। इस दृष्टिकोण में पीएच गतिशीलता को मापने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री के साथ संयोजन में एक पीएच-संवेदनशील हेरिटेबल प्रोटीन सेंसर शामिल है, दोनों समय-पाठ्यक्रम परख के रूप में और एक उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन प्रारूप में।

Abstract

ग्लूकोज चयापचय अफ्रीकी ट्रिपैनोसोम, ट्रिपैनोसोमा ब्रुसी के लिए महत्वपूर्ण है, एक आवश्यक चयापचय प्रक्रिया और परजीवी विकास के नियामक के रूप में। पर्यावरणीय ग्लूकोज के स्तर में परिवर्तन होने पर उत्पन्न सेलुलर प्रतिक्रियाओं के बारे में बहुत कम जानकारी है। रक्तप्रवाह और प्रोसाइक्लिक रूप (कीट चरण) परजीवी दोनों में, ग्लाइकोसोम में अधिकांश ग्लाइकोलाइसिस होते हैं। ग्लूकोज की कमी के जवाब में इन जीवों को तेजी से अम्लीकृत किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप हेक्सोकाइनेज जैसे ग्लाइकोलाइटिक एंजाइमों के एलोस्टेरिक विनियमन की संभावना होती है। पिछले काम में, पीएच माप बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली रासायनिक जांच का स्थानीयकरण चुनौतीपूर्ण था, अन्य अनुप्रयोगों में इसकी उपयोगिता को सीमित करना।

यह पत्र परजीवी के विकास और उपयोग का वर्णन करता है जो ग्लाइकोसोमली स्थानीयकृत pHluorin2, एक आनुवंशिक प्रोटीन पीएच बायोसेंसर व्यक्त करता है। pHluorin2 एक अनुपातमितीय pHluorin संस्करण है जो 395 एनएम पर उत्तेजना में पीएच (एसिड) पर निर्भर कमी प्रदर्शित करता है, साथ ही साथ 475 एनएम पर उत्तेजना में वृद्धि करता है। ट्रांसजेनिक परजीवी pHluorin2 ओपन रीडिंग फ्रेम को ट्रिपैनोसोम एक्सप्रेशन वेक्टर pLEW100v5 में क्लोन करके उत्पन्न किए गए थे, जो किसी भी जीवनचक्र चरण में इंड्यूसिबल प्रोटीन अभिव्यक्ति को सक्षम करते हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग pHluorin2 बायोसेंसर के ग्लाइकोसोमल स्थानीयकरण की पुष्टि करने के लिए किया गया था, जो बायोसेंसर के स्थानीयकरण की तुलना ग्लाइकोसोमल निवासी प्रोटीन एल्डोलेज़ से करता है। सेंसर जवाबदेही को 4 से 8 तक पीएच में फैले बफ़र्स की एक श्रृंखला में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करके अलग-अलग पीएच स्तरों पर कैलिब्रेट किया गया था, एक दृष्टिकोण जिसे हमने पहले फ्लोरेसिन-आधारित पीएच सेंसर को कैलिब्रेट करने के लिए उपयोग किया था। फिर हमने ग्लाइकोसोमल पीएच निर्धारित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके 405 एनएम और 488 एनएम पर पीएच 2 प्रतिदीप्ति को मापा। हमने लाइव ट्रांसजेनिक pHluorin2-व्यक्त परजीवी के प्रदर्शन को मान्य किया, ग्लूकोज अभाव के जवाब में समय के साथ पीएच की निगरानी की, पीएफ परजीवी में ग्लाइकोसोमल अम्लीकरण का एक ज्ञात ट्रिगर। इस उपकरण में संभावित अनुप्रयोगों की एक श्रृंखला है, जिसमें संभावित रूप से उच्च-थ्रूपुट ड्रग स्क्रीनिंग में उपयोग किया जा रहा है। ग्लाइकोसोमल पीएच से परे, सेंसर को अन्य ऑर्गेनेल के अनुकूल बनाया जा सकता है या लाइव सेल सेटिंग में पीएच गतिशीलता को समझने के लिए अन्य ट्रिपैनोसोमैटिड्स में उपयोग किया जा सकता है।

Introduction

परजीवी कीनेटोप्लास्टिड्स, अधिकांश जीवित जीवों की तरह, केंद्रीय कार्बन चयापचय के मूलभूत घटक के रूप में ग्लूकोज पर भरोसा करते हैं। इस समूह में चिकित्सकीय रूप से महत्वपूर्ण जीव शामिल हैं, जैसे कि अफ्रीकी ट्रिपैनोसोम, ट्रिपैनोसोमा ब्रुसी; अमेरिकी ट्रिपैनोसोम, टी। और जीनस लीशमैनिया के परजीवी। रोगजनक जीवनचक्र चरणों में परजीवी वृद्धि के लिए ग्लूकोज चयापचय महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, ग्लूकोज से वंचित होने पर, अफ्रीकी ट्रिपैनोसोम का रक्तप्रवाह रूप (बीएसएफ) तेजी से मर जाता है। विशेष रूप से, ग्लाइकोलाइसिस संक्रमण के इस चरण के दौरान एटीपी के एकमात्र स्रोत के रूप में कार्य करताहै। लीशमैनिया परजीवी इसी तरह मानव मेजबान में ग्लूकोज पर निर्भर होते हैं, एमास्टिगोट जीवनचक्र चरण के साथ जो मेजबान मैक्रोफेज में रहता है जो विकास के लिए इस कार्बन स्रोत पर निर्भर करताहै।

जबकि इन परजीवियों में अलग-अलग कीट वैक्टर शामिल हैं, वे कई समानताएं साझा करते हैं कि वे ग्लूकोज का जवाब और उपभोग कैसे करते हैं। उदाहरण के लिए, ये परजीवी अधिकांश ग्लाइकोलाइटिक एंजाइमों को ग्लाइकोसोम नामक संशोधित पेरोक्सीसोम में स्थानीयकृत करते हैं। यह कीनेटोप्लास्टिड-विशिष्ट ऑर्गेनेल संरक्षित बायोसिंथेटिक तंत्र औरआकृति विज्ञान 3,4,5,6के आधार पर स्तनधारी पेरोक्सीसोम से संबंधित है।

ग्लाइकोसोम में अधिकांश ग्लाइकोलाइटिक मार्ग एंजाइमों का कम्पार्टमेंटलाइजेशन मार्ग के नियमन के परजीवी-विशिष्ट साधन प्रदान करता है। एक रासायनिक पीएच जांच का उपयोग करते हुए, हमने स्थापित किया कि पोषक तत्वों की कमी प्रोसाइक्लिक फॉर्म (पीएफ) परजीवी ग्लाइकोसोम के तेजी से अम्लीकरण को ट्रिगर करती है जिसके परिणामस्वरूप प्रमुख ग्लाइकोलाइटिक एंजाइम हेक्सोकाइनेज 7,8पर एलोस्टेरिक नियामक बाध्यकारी साइट के संपर्क के माध्यम से परिवर्तित ग्लाइकोलाइटिक एंजाइम गतिविधि होती है। हमारे पिछले काम में, रासायनिक जांच को उपयोग के लिए निरंतर वितरण की आवश्यकता होती है, अन्य अनुप्रयोगों में इसकी उपयोगिता को सीमित करता है। इसके अतिरिक्त, बीएसएफ में ग्लाइकोसोम में जांच वितरण को बनाए रखने की चुनौतियों ने उस जीवन चरण में ग्लाइकोसोमल पीएच की जांच के लिए दृष्टिकोण की उपयोगिता को सीमित कर दिया।

इस अध्ययन में, हमने ग्लूकोज भुखमरी9 (चित्रा 1) सहित पर्यावरणीय संकेतों के जवाब में बीएसएफ टी ब्रुसी में ग्लाइकोसोमल पीएच परिवर्तन की निगरानी के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन बायोसेंसर पीएच 2 का उपयोग किया है। इस काम के परिणाम बताते हैं कि बीएसएफ टी ब्रुसी एक प्रतिवर्ती फैशन में भुखमरी के जवाब में ग्लाइकोसोम को तेजी से अम्लीकृत करता है, जैसा कि हमने पीएफ परजीवी में देखा है। हम उम्मीद करते हैं कि यह बायोसेंसर ग्लाइकोलाइटिक विनियमन की हमारी समझ में सुधार करेगा टी।

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Protocol

टी. ब्रुसी ब्रुसी 90-13 बीएसएफ ट्रिपैनोसोम, एक मोनोमॉर्फिक परजीवी लाइन का उपयोग करने के लिए सुरक्षा पर विचार करने की आवश्यकता होती है क्योंकि उन्हें जोखिम समूह 2 जीव माना जाता है जिन्हें जैव सुरक्षा स्तर 2 सुविधाओं में संभाला जाना चाहिए।

1. ट्रिपैनोसोम संस्कृति और अभिकर्मक

  1. संस्कृति टी. Brucei brucei 90-13 बीएसएफ tripanosomes एचएमआई -9 माध्यम में 10% गर्मी निष्क्रिय FBS और 10% Nu-सीरम 5% सीओ210 में 37 डिग्री सेल्सियस पर के साथ पूरक.
    नोट: संस्कृति को स्वस्थ रखने के लिए, 2 × 104 और 5 × 106 कोशिकाओं / एमएल के बीच सेल घनत्व बनाए रखें।
  2. pLEW100v5 में pHluorin2-PTS1 क्लोनिंग
    1. pHluorin2 ओपन रीडिंग फ्रेम को व्यावसायिक रूप से संश्लेषित करें ताकि जीन को 3 'एक्सटेंशन एन्कोडिंग के साथ दो ग्लाइसिन लिंकर को ट्राइपेप्टाइड AKL, एक PTS1 स्थानीयकरण टैग के बाद प्राप्त किया जा सके।
    2. इस निर्माण को इंड्यूसिबल ट्रिपैनोसोम एक्सप्रेशन वेक्टर pLEW100v5 में प्रतिबंध डाइजेस्ट द्वारा क्लोन करें। हिंदIII और बामही11 का उपयोग करके pHluorin2-PTS1 और pLEW100v5 युक्त क्लोनिंग वेक्टर दोनों को डबल डाइजेस्ट करें। एक सफाई कदम करें, अधिमानतः agarose जेल शुद्धि द्वारा, प्रतिबंध एंजाइमों, अवांछित क्लोनिंग वेक्टर रीढ़ की हड्डी, और excised luciferase जीन युक्त टुकड़ा को हटाने के लिए.
    3. PHluorin2-असर डालने को पचाने वाले pLEW100v5 में T4 डीएनए लिगेज12 के साथ लिगेट करें। (क्लोनिंग के लिए एक योजना के लिए पूरक चित्र S1 देखें)।
  3. सम्मिलित करने और वेक्टर सही ढंग से ligated हैं सत्यापित करने के लिए अगली पीढ़ी पूरे प्लाज्मिड अनुक्रमण द्वारा प्लाज्मिड अनुक्रम और क्लोनिंग प्रक्रिया के दौरान pHluorin2-PTS1 जीन के भीतर कोई उत्परिवर्तन पेश कर रहे हैं कि.
    नोट: पूरा प्लाज्मिड अनुक्रम Addgene.org को प्रस्तुत किया गया है और #83680 सौंपा गया है।
  4. NotI की 40 इकाइयों के साथ पचाने से प्लाज्मिड के 20 μg को रैखिक करें; फिर, संदर्भित मानव टी-सेल किट ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके न्यूक्लियोफेक्शन के माध्यम से बीएसएफ 90-13 परजीवी में ट्रांसफ़ेक्ट करें। Burkard एट al.13 द्वारा वर्णित के रूप में स्थिर एकीकरण के लिए चयन करें.

2. pHlourin2-PTS1 का इम्यूनोफ्लोरेसेंस कोलोकलाइज़ेशन

  1. 10 मिनट के लिए एच2ओ में पाली-एल-लाइसिन 0.1% (डब्ल्यू / पॉली-एल-लाइसिन समाधान को हटाने के बाद, पीबीएस के साथ एक बार स्लाइड धो लें।
  2. pHluorin2-PTS1 अभिव्यक्ति प्रेरित करने के लिए, फसल से पहले 24 घंटे टेट्रासाइक्लिन या डॉक्सीसाइक्लिन (1 μg/mL) के साथ 2 ×10 5 कोशिकाओं/एमएल पर कोशिकाओं का इलाज करें। गोली 2 × 106 माता-पिता और प्रेरित pLEWpHluorin2-PTS1 (पीएचएल) सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा परजीवी (कमरे का तापमान [आरटी], 10 मिनट, 1,000 × ग्राम) और पीबीएस के साथ एक बार धो लें।
  3. व्यावसायिक रूप से आपूर्ति किए गए 16% ईएम ग्रेड समाधान से बने पीबीएस में ताजा तैयार 2% पैराफॉर्मलाडेहाइड के 200 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। स्लाइड के लिए लगानेवाला में कोशिकाओं को लागू करें और कोशिकाओं 30 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं. धोने के समाधान (पीबीएस में 0.1% सामान्य बकरी सीरम) के साथ पालन कोशिकाओं 2x धो लें.
  4. कोशिकाओं के लिए पारगम्यता समाधान (पीबीएस में 0.5% ट्राइटन एक्स-100) लागू करें और ठीक 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। पारगम्यता समाधान निकालें और धोने के समाधान की पर्याप्त मात्रा के साथ एक बार धो लें।
  5. ब्लॉक समाधान (पीबीएस में 10% सामान्य बकरी सीरम और 0.1% ट्राइटन एक्स-100) लागू करें और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. ब्लॉक समाधान में टी. ब्रुसी एल्डोलेज 1:500 के खिलाफ उठाए गए एंटीसेरा को पतला करें और इसे कोशिकाओं पर लागू करें14. आरटी पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। धोने के समाधान के साथ 3-5 मिनट मिनट के लिए 5x के लिए स्लाइड धोएं।
  7. ब्लॉक समाधान में बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा फ्लोर 568 1: 1,000 पतला करें और कोशिकाओं पर लागू करें। आरटी पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। धोने के समाधान के साथ 3-5 मिनट के लिए 5x के लिए स्लाइड धो लें।
  8. बढ़ते माध्यम लागू करें और स्लाइड करने के लिए एक coverslip सील.
  9. एक 100x उद्देश्य (एनए 1.4-0.7) के साथ कोशिकाओं छवि और ImageJ का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण. ImageJ के लिए 'Coloc 2' प्लग में का उपयोग पियर्सन के colocalization विश्लेषण प्रदर्शन. प्रतिनिधि कोशिकाओं के क्षेत्र के लिए पूरक चित्रा एस 2 देखें। )
    1. इसे पूरा करने के लिए, छवि फ़ाइल को फिजी में जोड़ें और चुनें छवियाँ.
    2. प्रत्येक चैनल के लिए चमक और कंट्रास्ट को उस बिंदु पर समायोजित करें जिसमें कोई पृष्ठभूमि दिखाई न दे।
    3. छवियों को 16-बिट से 8-बिट में बदलें, छवियों को मर्ज करें, और फिर विभाजित चैनलों के साथ एकल कक्ष में क्रॉप करें।
    4. विश्लेषण और सहस्थानीयकरण के अंतर्गत, Coloc2 प्लग-इन चुनें। चैनल 1 के रूप में एल्डोलेज (लाल चैनल) और चैनल 2 के रूप में पीएचएल (ग्रीन चैनल) का चयन करें और पियर्सन के सहसंबंध की गणना शुरू करने के लिए ठीक क्लिक करें।

3. प्रवाह साइटोमेट्री के लिए नमूना तैयार करना

  1. रात भर टेट्रासाइक्लिन या डॉक्सीसाइक्लिन (1 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ पीएचएल कोशिकाओं को प्रेरित करें।
  2. सेंट्रीफ्यूजेशन (आरटी, 10 मिनट, 1,000 × ग्राम) द्वारा कोशिकाओं (~ 4 × 107 पीएचएल और ~ 1 × 106 माता-पिता) को गोली दें। सतह पर तैरनेवाला निकालें और नमूना भूखा है या नहीं या संयुक्त राष्ट्र भूखे है कि क्या इस पर निर्भर करता है कि या तो 10 मिमी ग्लूकोज के साथ या बिना पीबीएस के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। समय-पाठ्यक्रम परख के लिए, 10 एमएम ग्लूकोज के साथ पूरक पीबीएस में पुन: निलंबित करें ताकि कोशिकाओं को भूख से मरने से रोका जा सके जब तक कि वॉश पूरा न हो जाए। उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन (एचटीएस) परख के लिए, ग्लूकोज के कैरीओवर को कम करने के लिए ग्लूकोज के बिना पीबीएस में फिर से निलंबित करें; वॉश को दो बार दोहराएं।
  3. एक चौथी बार के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला हटा दें, और उपचार के आधार पर या तो पीबीएस, पीबीएस प्लस 5 एमएम ग्लूकोज, या पीबीएस प्लस 10 एमएम ग्लूकोज में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। जीवित/मृत निर्धारण के लिए या तो 1 μg/mL प्रोपिडियम आयोडाइड (PI) या 100 nM थियाज़ोल लाल (TR) के साथ नमूनों को पूरक करें। प्रत्येक नमूने को फ्लो साइटोमीटर के साथ संगत 5 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें।

4. फ्लो साइटोमेट्री

नोट: निम्नलिखित लेज़रों युक्त एक प्रवाह साइटोमीटर पर प्रयोग तैयार करें: 405 एनएम (बैंगनी), 488 एनएम (नीला), और 561 एनएम (पीला) या 638 एनएम (लाल)। नीचे चर्चा किए गए चैनलों के सामान्य नामों के लिए पूरक तालिका एस 1 देखें।

  1. पीएचएल प्रतिदीप्ति को मापने के लिए, चैनल KO525 (VL2-H, उत्तेजना 405 एनएम, उत्सर्जन 542/27 एनएम) और FITC (BL1-H, उत्तेजना 488 एनएम, उत्सर्जन 530/30 एनएम) का उपयोग करें। मृत कोशिकाओं से जीवित कोशिकाओं को अलग करने के लिए, पीआई या टीआर का उपयोग करें; YL2-H चैनल पर PI को मापें (उत्तेजना 561 एनएम, उत्सर्जन 620/25 एनएम)। आरएल 1-एच चैनल (638 एनएम उत्तेजना, 660/10 बीपी) पर टीआर मापें।
    1. फ्लो साइटोमीटर सॉफ्टवेयर पर प्रयोग स्थापित करने के लिए, निम्नलिखित भूखंड बनाएं: 1) YL2-H चैनल हिस्टोग्राम (यदि पीआई का उपयोग कर रहे हैं) या एक आरएल 1-एच चैनल हिस्टोग्राम (यदि टीआर का उपयोग कर रहे हैं), 2) एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए डॉट प्लॉट, 3) एफएससी-ए बनाम एफएससी-एच डॉट प्लॉट, और 4) बीएल 1-एच बनाम वीएल 2-एच चैनल डॉट प्लॉट।
    2. पहले नमूना इंजेक्शन बंदरगाह (एसआईपी) पर बेदाग डब्ल्यूटी (माता पिता सेल लाइन) नियंत्रण रखें और स्थिति में मंच बढ़ा. आवश्यक समायोजन करने के लिए समय देने के लिए सबसे कम प्रवाह दर पर साइटोमीटर पर डेटा प्राप्त करना शुरू करें। नकली मलबे और मृत कोशिकाओं स्कोरिंग से बचने के लिए, नमूना अधिग्रहण शुरू होने के बाद घटनाओं 5 एस रिकॉर्डिंग शुरू.
    3. YL2 या RL1 वोल्टेज समायोजित करें ताकि मुख्य शिखर 103-10 4 सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता (RFI) इकाइयों के भीतर हो। FSC और SSC वोल्टेज समायोजित करें ताकि >90% इवेंट डॉट प्लॉट पर फिट हों। मलबे की आबादी को बाहर करने के लिए एफएससी थ्रेशोल्ड को समायोजित करें लेकिन संभावित कोशिकाओं को नहीं।
    4. VL2 और BL1 चैनलों को समायोजित करें ताकि प्राथमिक शिखर बिना दाग वाले WT नियंत्रण के लिए 103-10 4 RFI इकाइयों के भीतर हो।
    5. एसआईपी पर पीआई या टीआर के साथ दाग प्रेरित पीएचएल युक्त पहला नमूना रखें और चरण को स्थिति में बढ़ाएं। सबसे कम प्रवाह दर पर डेटा प्राप्त करना शुरू करें और प्रत्येक प्लॉट में घटनाओं का ध्यानपूर्वक निरीक्षण करें। सुनिश्चित करें कि >90% ईवेंट प्रत्येक प्लॉट के भीतर हैं और कोई भी ईवेंट VL2-H और BL1-H चैनलों को संतृप्त नहीं कर रहा है।
  2. नमूने चलाने के साथ आगे बढ़ें। प्रति नमूना कम से कम 10,000 घटनाओं को रिकॉर्ड करना सुनिश्चित करें।
  3. नमूनों से डेटा को .fcs फ़ाइल स्वरूप में सहेजें और विश्लेषण के लिए निर्यात करें।

5. प्रवाह साइटोमेट्री परिणामों का डेटा विश्लेषण

नोट: यह डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो FlowJo सॉफ़्टवेयर का उपयोग करता है। यदि अन्य प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जाता है, तो सॉफ्टवेयर-उपयुक्त उपकरणों का उपयोग करके नीचे वर्णित प्रमुख चरणों का पालन करना जारी रखें। भूखंडों और गेटिंग की कल्पना करने के लिए, पूरक चित्र S3 और पूरक चित्र S4 देखें।

  1. एक नया लेआउट खोलें और चरण 4.3 में अधिग्रहित .fcs फ़ाइलें खोलें। .fcs फ़ाइलों को लेआउट विंडो में खींचें और छोड़ें।
  2. जीवित कोशिकाओं के लिए गेट।
    1. इस नमूने के लिए विंडो खोलने के लिए दाग रहित WT नियंत्रण डबल-क्लिक करें।
    2. डेटा को YL2-H चैनल (यदि PI का उपयोग कर रहे हैं) या RL2-H (यदि TR का उपयोग कर रहे हैं) चैनल पर हिस्टोग्राम के रूप में देखें। जीवित और मृत आबादी की पहचान करने के लिए व्यवहार्यता डाई के साथ दाग नमूनों के बीच टॉगल करें।
      नोट: सभी घटनाओं को बेदाग होना चाहिए क्योंकि इस नमूने में व्यवहार्यता डाई नहीं जोड़ा गया था।
    3. जीवित और मृत आबादी को विभाजित करने वाला एक द्विभाजक गेट बनाएं; बाएं गेट को लाइव और दाएं गेट को डेड नाम दें। इस गेट को सभी नमूनों पर लागू करें, फिर नमूनों के बीच टॉगल करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि यह गेट सभी नमूनों के लिए उचित रूप से तैयार किया गया है। आवश्यकतानुसार गेट को समायोजित करें।
  3. कोशिकाओं के लिए गेट।
    1. बेदाग WT नियंत्रण पर, उस गेट में घटनाओं को देखने के लिए लाइव गेट पर डबल-क्लिक करें। डॉट प्लॉट x-axis को FSC-A और y-axis को SSC-A में बदलें।
    2. सेल आबादी के चारों ओर एक गेट खींचने के लिए बहुभुज गेट उपकरण का उपयोग करें और इसे सेल नाम दें। मलबे/मरने वाली कोशिकाओं (आमतौर पर डॉट प्लॉट के बहुत बाएं और नीचे) और समुच्चय (डॉट प्लॉट के दाएं और ऊपर) को बाहर करने का ध्यान रखें।
    3. सभी नमूनों के लिए लाइव गेट के तहत इस गेट लागू करें. यह सुनिश्चित करने के लिए नमूनों के बीच टॉगल करें कि गेट सभी नमूनों के लिए संभावित सेल आबादी को शामिल करता है और आवश्यक समायोजन करता है। इसे बदलने के बाद सभी नमूनों के लिए गेट को फिर से लागू करना सुनिश्चित करें।
      नोट: सेल जनसंख्या वितरण एफएससी बनाम एसएससी पर भूखे और अन-भूखे स्थितियों के बीच काफी बदल जाता है; सुनिश्चित करें कि सेल गेट सभी स्थितियों में सेल आबादी को शामिल करता है।
  4. पीएच माप की गुणवत्ता बढ़ाने के लिए एकल कोशिकाओं के लिए गेट।
    1. बेदाग WT नियंत्रण पर, उस गेट में घटनाओं को देखने के लिए सेल गेट पर डबल-क्लिक करें। डॉट प्लॉट x-axis को FSC-A और y-axis को FSC-H में बदलें।
    2. इस डॉट प्लॉट पर एकल कोशिकाओं के विकर्ण वितरण की तलाश करें, जिसमें डबल्स सिंगलेट आबादी के निचले दाएं हिस्से में एक माध्यमिक आबादी बनाते हैं ( पूरक चित्र एस 1 तीसरा प्लॉट देखें)। बहुभुज गेट उपकरण का उपयोग करके, दोहरी आबादी को छोड़कर सिंगलेट घटनाओं के चारों ओर एक गेट खींचें। इस गेट का नाम सिंगलेट्स रखें।
    3. सभी नमूनों के लिए सेल गेट के नीचे सिंगलेट गेट लागू करें। फिर से, यह सुनिश्चित करने के लिए नमूनों के बीच टॉगल करें कि गेट सिंगलेट आबादी को ठीक से बाहर कर रहा है, जबकि सिंगलेट आबादी को शामिल किया गया है। आवश्यकतानुसार समायोजित करें।
  5. फ्लोरोसेंट पीएचएल कोशिकाओं के लिए गेट।
    1. बेदाग WT नियंत्रण नमूने पर, उस आबादी के लिए एक डॉट प्लॉट खोलने के लिए सिंगलेट गेट पर डबल-क्लिक करें। x-अक्ष को BL1-H और y-अक्ष को VL2-H में बदलें।
    2. पीएच सेंसर pHluorin2 VL2 और BL1 दोनों में फ्लोरोसेंट है। बहुभुज गेट उपकरण का उपयोग करने के लिए एक विकर्ण आकार गेट ऊपर करने के लिए और सही डॉट साजिश के निचले बाएँ में autofluorescent आबादी से दूर करने के लिए विस्तार. इस गेट pHL+ को नाम दें।
    3. सभी नमूनों के लिए सिंगलेट गेट के नीचे पीएचएल + गेट लागू करें। एक पीएचएल नमूने के लिए टॉगल और डब्ल्यूटी नियंत्रण की तुलना में वीएल 2-एच और बीएल 1-एच दोनों में अधिक प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ घटनाओं को शामिल करने के लिए गेट को समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि यह गेट सभी नमूनों के लिए इस फ्लोरोसेंट आबादी को शामिल करता है क्योंकि इस आबादी की स्थिति ग्लाइकोसोमल पीएच परिवर्तन के रूप में बदल जाएगी।
      नोट: पीएचएल + आबादी में यह छोटा लेकिन दृश्यमान बदलाव फ्लोरोफोर के उत्तेजना स्पेक्ट्रम में पीएच-निर्भर परिवर्तनों के कारण है।
  6. आँकड़े निर्यात करें.
    1. टेबल एडिटर पर क्लिक करें | बार संपादित करें | निर्यात करने के लिए नए आँकड़े जोड़ने के लिए स्तंभ जोड़ें.
      नोट: निर्यात करने के लिए प्रत्येक आंकड़े के लिए, संबंधित आंकड़े चुनें और इसे किस आबादी से निर्यात करना है। माध्यिका जैसे लागू आँकड़ों के लिए उपयुक्त पैरामीटर चुनना सुनिश्चित करें. नमूना अपरिवर्तित छोड़ दें।
    2. निम्नलिखित आँकड़ों के साथ कॉलम जोड़ें: कुल (अनगेटेड) गणना, pHL+ गणना, कुल का लाइव फ़्रीक (कुल घटनाओं के आधार पर प्रतिशत), pHL+ फ़्रीक माता-पिता का (पैरेंट गेट पर आधारित प्रतिशत), pHL+ माध्यिका VL2-H, और pHL+ माध्यिका BL1-H।
    3. तालिका संपादक पर क्लिक करें और निम्नलिखित निर्यात सेटिंग्स बदलें: फ़ाइल में प्रदर्शित करें और CSV में टेक्स्ट करें और फिर फ़ाइल गंतव्य और नाम चुनें। Create Table पर क्लिक करें।
  7. प्रतिदीप्ति अनुपात की गणना.
    1. निर्यात की गई .csv फ़ाइल को स्प्रेडशीट फ़ाइल के रूप में सहेजें।
    2. प्रयोग में सभी नमूनों में निम्नलिखित की तुलना करके गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण करें: प्रति नमूना घटनाओं की संख्या, लाइव घटनाओं का प्रतिशत और पीएचएल + घटनाओं का प्रतिशत। प्रयोग के आधार पर बार या तितर बितर भूखंडों में इन नेत्रहीन तुलना करें.
    3. एक नए कॉलम को pHL+ मेडियन VL2/BL1 के रूप में लेबल करें। प्रत्येक नमूने के लिए, माध्यिका VL2-H मान को माध्यिका BL1-H मान से विभाजित करें जैसा कि समीकरण (1) में दिखाया गया है।
      Equation 1(1)
  8. प्रतिदीप्ति अनुपात का उपयोग कर सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें.

6. पीएच बायोसेंसर अंशांकन

नोट: मापा प्रतिदीप्ति अनुपात को पीएच इकाइयों में परिवर्तित करने के लिए, नाइजीरिसिन और वैलिनोमाइसिन का उपयोग करके पीएचएल-व्यक्त कोशिकाओं को जांचें। नाइजेरिसिन एक K+/H+ एंटीपोर्टर है, एक आयनोफोर जो बफर15 में पर्याप्त K+ होने पर झिल्ली में पीएच को संतुलित कर सकता है। नाइजीरिसिन आमतौर पर pHluorin और अन्य पीएच सेंसर16,17 जांचना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. के रूप में peroxisomally स्थानीयकृत pHluorin पहले 10 माइक्रोननाइजेरिसिन 18 का उपयोग कर कैलिब्रेट किया गया था, हम उस एकाग्रता के साथ इलाज करने के लिए चुना. वैलिनोमाइसिन एक पोटेशियम आयनोफोर है और इसका उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली19 में पीएच को संतुलित करने के लिए (4 माइक्रोन पर) किया गया है। हमने नाइजेरिसिन की पीएच संतुलन गतिविधि की सहायता के लिए 10 माइक्रोन वैलिनोमाइसिन का उपयोग किया, यह सुनिश्चित करके कि के + आयनों को झिल्ली में संतुलित किया गया था। जबकि हम एक नाइजीरिसिन-वैलिनोमाइसिन संयोजन का उपयोग करते हैं, नाइजीरिसिन ऑर्गेनेलर पीएच को संतुलित करने के लिए पर्याप्त हो सकता है।

  1. सार्वभौमिक अंशांकन बफर (यूसीबी; 15 एमएम एमईएस, 15 एमएम एचईपीईएस, और 130 एमएम केसीएल) के आठ समाधान तैयार करें, प्रत्येक 5 से 8.5 तक के एक अलग पीएच पर।
  2. अपकेंद्रित्र (आरटी, 10 मिनट, 800-1,000 × जी) पीएचएल-व्यक्त बीएसएफ संस्कृति के 2 एमएल के आठ अलग-अलग ट्यूब (~ 4 × 106 कोशिकाएं प्रत्येक)।
  3. सतह पर तैरनेवाला निकालें और फिर अलग पीएच मूल्यों पर यूसीबी में प्रत्येक सेल गोली respended.
  4. नाइजीरिसिन और वैलिनोमाइसिन का परिचय दें, प्रत्येक 10 माइक्रोन तक। पीआई में स्पाइक 1 माइक्रोग्राम / एमएल तक।
  5. 15 मिनट के लिए प्रत्येक समाधान में कोशिकाओं को सेते हैं।
  6. 4-5 चरणों में वर्णित प्रतिदीप्ति अनुपात को मापने के लिए एक प्रवाह साइटोमीटर पर प्रत्येक नमूना चलाएं।
  7. प्रत्येक पीएच मान के लिए तीन जैविक प्रतिकृतियां प्राप्त करने के लिए इस प्रयोग को दो बार और दोहराएं। डेटा को .fcs स्वरूप में निर्यात करें.
  8. 5.8 के माध्यम से चरण 5.1 में वर्णित .fcs फ़ाइलों का विश्लेषण करें। समीकरण (2) का उपयोग करके भविष्य के प्रयोगों में ग्लाइकोसोमल पीएच को प्रक्षेपित करने के लिए प्रत्येक पीएच के लिए मापा प्रतिदीप्ति अनुपात का उपयोग करें।
    Equation 2(2)
    नोट: पूरक चित्रा एस 3 डॉट भूखंडों और गेटिंग योजना से पता चलता है. परिणाम पूरक तालिका S2 में पाए जा सकते हैं। निम्नलिखित वर्णन करता है कि ग्राफपैड प्रिज्म का उपयोग करके प्रतिदीप्ति अनुपात से पीएच को कैसे प्रक्षेपित किया जाए। यदि अन्य सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर रहे हैं, तो समान महत्वपूर्ण चरणों का पालन करें।
    1. ग्राफपैड प्रिज्म खोलें और तीन वाई-प्रतिकृतियों के साथ एक एक्सवाई तालिका बनाएं। एक्स-कॉलम में पीएच मान और वाई-प्रतिकृति कॉलम में उनके संबंधित प्रतिदीप्ति अनुपात मान पेस्ट करें।
    2. तालिका से जुड़े ग्राफ पर क्लिक करें। ग्राफ़ देखते समय, विश्लेषण रिबन के तहत विश्लेषण पर क्लिक करें | XY विश्लेषण के तहत एक मानक वक्र को प्रक्षेपित करें।
    3. सिग्मोइडल चुनें, 4PL, X लॉग (एकाग्रता) है क्योंकि पीएच इकाइयां लघुगणकीय पैमाने पर हैं। ऊपर और नीचे पैरामीटर अनुमानित ऊपर और नीचे पठार हैं। आउटलेयर की कोई विशेष हैंडलिंग नहीं चुनें।
      नोट: सॉफ्टवेयर समीकरण (2) और चरण 6.9.3 में वर्णित मॉडल के लिए डेटा फिट करने की कोशिश करेगा। परिणामों की तालिका और ग्राफ पर वक्र में फिट की कमी के सबूत के लिए देखो.
    4. अन्य प्रयोगों में प्रतिदीप्ति अनुपात से पीएच प्रक्षेपित करने के लिए, पीएचएल अंशांकन डेटा के साथ तालिका पर जाएं। वाई-कॉलम (एस) में अंशांकन डेटा के नीचे प्रतिदीप्ति अनुपात मूल्यों को पेस्ट करें। प्रत्येक y-मान को एक शीर्षक दें लेकिन x-मान (pH) को खाली छोड़ दें क्योंकि यह अज्ञात है।
    5. परिणाम गैलरी में, प्रक्षेप विश्लेषण पर क्लिक करें और फिर इंटरपोलेटेड एक्स प्रतिकृति टैब पर जाएं। इंटरपोलेटेड पीएच मानों की तलाश करें जो दर्ज किए गए प्रतिदीप्ति अनुपात मूल्यों के साथ सूचीबद्ध होंगे।
      नोट: सॉफ्टवेयर अंशांकन डेटा से पाए गए मॉडल और सर्वश्रेष्ठ-फिट पैरामीटर मानों का उपयोग उन प्रयोगों के लिए प्रतिदीप्ति अनुपात से पीएच को प्रक्षेपित करने के लिए करता है जहां पीएच अज्ञात है।

7. ग्लूकोज भुखमरी और एडबैक टाइम-कोर्स

  1. बीएसएफ पीएचएल परजीवी के 15 एमएल को रातोंरात 1 माइक्रोग्राम/एमएल डॉक्सीसाइक्लिन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया जैसा कि चरण 1.1 में वर्णित है।
  2. 10 एमएम ग्लूकोज के साथ पूरक पीबीएस में प्रेरित पीएचएल संस्कृति के 15 एमएल धोएं। इस चरण 3x दोहराएँ.
    1. समवर्ती रूप से, पीबीएस 3x में डब्ल्यूटी संस्कृति के 3 एमएल को धोएं जैसा कि चरण 3.2 में वर्णित है।
    2. पहली बार धोने के बाद जब पीएचएल नमूना पीबीएस के 1 एमएल में फिर से निलंबित हो जाता है, तो पीएचएल सेल निलंबन के 0.1 एमएल विभाज्य को हटा दें ताकि 10 एमएम ग्लूकोज को संयुक्त राष्ट्र के भूखे नियंत्रण के रूप में रखा जा सके।
  3. अंतिम धोने के बाद, 1 माइक्रोग्राम/एमएल पीआई के साथ पूरक पीबीएस में पीएचएल नमूना को फिर से निलंबित करें।
  4. प्रवाह साइटोमेट्री डेटा प्राप्त करना
    1. प्रयोग और नमूने के आधार पर, हर 5, 10, 30, या 90 मिनट में प्रवाह साइटोमीटर पर प्रत्येक नमूने को मापकर भूखे और संयुक्त राष्ट्र के भूखे दोनों नमूनों के लिए ग्लाइकोसोमल पीएच की निगरानी शुरू करें। 4.3 के माध्यम से चरण 4.1 में वर्णित प्रवाह साइटोमेट्री डेटा प्राप्त करें, यह सुनिश्चित करना कि वोल्टेज और भूखंड पहले से तैयार किए गए हैं।
    2. बेदाग WT नियंत्रण को पहले 0 मिनट पर चलाएं।
    3. 0 मिनट से शुरू होने वाले हर 90 मिनट में साइटोमीटर पर संयुक्त राष्ट्र के भूखे नियंत्रण नमूना चलाएं। भुखमरी समय पाठ्यक्रम परख के लिए, 0 मिनट से शुरू हर 10 मिनट भूखे नमूना चलाने. ग्लूकोज ऐडबैक परख के लिए, भूखे नमूने को 0, 5, 10, 20, 30, 60 और 90 मिनट पर चलाएं; फिर, ग्लूकोज शुरू करने के बाद दोहराएं।
    4. 90 मिनट भुखमरी समय पाठ्यक्रम और 180 मिनट ग्लूकोज एडबैक समय पाठ्यक्रम के दौरान कमरे के तापमान पर नमूने सेते हैं।
  5. 5.8 के माध्यम से चरण 5.1 में वर्णित .fcs फ़ाइलों का विश्लेषण करें।
    नोट: पूरक चित्रा एस 4 से पता चलता है कि गेटिंग कैसे करें और डॉट प्लॉट कैसा दिखना चाहिए। पूरक तालिका एस 3 और पूरक तालिका एस 4 क्रमशः ग्लूकोज भुखमरी समय पाठ्यक्रम परख और ग्लूकोज ऐड-बैक टाइम कोर्स परख के परिणाम दिखाते हैं।

8. दवा स्क्रीनिंग के लिए परख का अनुकूलन

  1. पीएचएल व्यक्त बीएसएफ परजीवी के लगभग 32 एमएल और डब्ल्यूटी कोशिकाओं के 3 एमएल, दोनों लगभग 2 × 106 कोशिकाओं / एमएल, पीबीएस में 2x के रूप में पहले वर्णित है।
    नोट: मापा प्रतिदीप्ति अनुपात की परिवर्तनशीलता को कम करने और जेड-कारक आंकड़े को सटीक रूप से मापने के लिए 10,000 से अधिक घटनाओं को अच्छी तरह से दर्ज करने की आवश्यकता है। इसे पूरा करने के लिए आवश्यक न्यूनतम संस्कृति लगभग 26 एमएल है, लेकिन हम हैंडलिंग में आसानी के लिए 32 एमएल की सलाह देते हैं।
    1. पहले धोने के बाद, पीएचएल नमूने को समान रूप से दो माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में अलग करें।
  2. washes के बाद, 5 मिमी ग्लूकोज, 0.1% DMSO, और TR युक्त पीबीएस के 18 एमएल में एक पीएचएल नमूना resuspend. पीबीएस प्लस 0.1% DMSO और टीआर के 18 एमएल में अन्य पीएचएल नमूना resuspend.
    नोट: डीएमएसओ का उपयोग दवा स्क्रीन में बफर संरचना की नकल करने के लिए किया जाता है क्योंकि यौगिकों को आमतौर पर डीएमएसओ में भंग कर दिया जाता है।
  3. इन दो सेल समाधानों को 12-अच्छी तरह से जलाशय, 9 एमएल प्रति कुएं में स्थानांतरित करें।
  4. एक 384 अच्छी तरह से थाली, अच्छी तरह से प्रति 80 माइक्रोन के अलग हिस्सों में सेल समाधान pipet करने के लिए एक पाइपिंग रोबोट का प्रयोग करें.
  5. 1.5 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर थाली सेते हैं, धीरे मिलाते हुए और प्रकाश से fluorophores की रक्षा के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे.
  6. 384 अच्छी तरह से प्लेटों को चलाने में सक्षम एक प्रवाह cytometer पर थाली भागो.
    नोट: निम्न वर्कफ़्लो को Attune NxT के साथ Cytkick Max Auto Sampler के लिए अनुकूलित किया गया है। यदि किसी अन्य प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग किया जाता है, तो प्रमुख चरणों का पालन करना जारी रखें।
    1. प्लेट के लिए, सबसे तेज़ प्रवाह दर (1,000 यूएल/मिनट) पर चलाएं और बूस्ट मोड को सक्षम करें। 20 माइक्रोन/वेल प्राप्त करें। प्रत्येक अच्छी तरह से के बीच एक मिश्रण चक्र और एक कुल्ला चक्र शामिल करें.
    2. चरण 4.1.3 में वर्णित के रूप में प्लॉट बनाएं।
    3. एक बेदाग WT ट्यूब नियंत्रण चलाएँ और चरण 4.1.3 और 4.1.4 में वर्णित वोल्टेज का अनुकूलन करें। एक भूखा पीएचएल ट्यूब नमूना चलाएं और चरण 2 में वर्णित वीएल 1 और बीएल 4.1 वोल्टेज का अनुकूलन करें।
    4. प्रवाह साइटोमीटर पर प्लेट प्राप्त करना शुरू करें। प्लेट को क्षैतिज रूप से चलाएं ताकि भूखे और अन-भूखे नमूना कुओं के बीच कोई महत्वपूर्ण अधिग्रहण समय अंतर न हो। सुनिश्चित करें कि प्लेट अधिग्रहण ~ 1.5 घंटे में समाप्त हो गया है।
  7. .fcs फ़ाइलें निर्यात करें और चरण 5.1 से 5.8 में वर्णित अनुसार डेटा का विश्लेषण करें. ग्लूकोज (जीएलसी) या कोई ग्लूकोज (भूखा) के साथ इलाज किए गए नमूनों के लिए प्रतिदीप्ति अनुपात के औसत (एवीजी) और मानक विचलन (एसडी) का पता लगाएं।
    नोट: हमारे जेड-कारक प्रयोगों से डेटा पूरक तालिका एस 5 में पाया जा सकता है।
  8. समीकरण (3) का उपयोग करके Z-कारक20 आँकड़ा परिकलित कीजिए।
    Equation 3(3)

Figure 1
चित्रा 1: लाइव बीएसएफ ट्रिपैनोसोम में ग्लाइकोसोमल पीएच स्कोर करने के लिए विधि का आरेख। (ए) ग्लाइकोसोमली स्थित पीएच 2 सेंसर व्यक्त करने वाली सेल लाइनों का चित्रण। पेरोक्सिसोमल लक्ष्यीकरण अनुक्रम का समावेश स्थानीयकरण पर नियंत्रण प्रदान करता है। नोट: हम आशा करते हैं कि पीटीएस -1 के उन्मूलन से साइटोसोलिक स्थानीयकरण होगा, जिससे उस उपकोशिकीय डिब्बे में पीएच के भविष्य के विश्लेषण की अनुमति मिलेगी। (बी) सेंसर सत्यापन परख का चित्रण। संक्षिप्तीकरण: बीएसएफ = रक्तप्रवाह रूप। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नोट: जेड-फैक्टर आँकड़ा का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जाता है कि एचटीएस के लिए परख कितनी उपयुक्त है। 0.5 और 1.0 के बीच मान आम तौर पर परख गुणवत्ता एचटीएस के लिए स्वीकार्य है का मतलब है.

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Representative Results

pHLuorin2-PTS1 बीएसएफ टी में ग्लाइकोसोम के लिए स्थानीयकरण ।
pHluorin2-PTS1 के उपकोशिकीय स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए, परजीवियों को इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख के अधीन किया गया था। एक ग्लाइकोसोम-निवासी प्रोटीन, एल्डोलेज़ (टीबीएल्डोलेज़)(चित्रा 2ए)के खिलाफ उठाए गए एंटी-सेरा के साथ ट्रांसजीन सहस्थानीयकृत से संकेत। एंटी-TbAldolase और pHluorin2-PTS1 के बीच सहस्थानीयकरण का औसत पियर्सन का सहसंबंध गुणांक 0.895 था, यह दर्शाता है कि pHluorin2-PTS1 मुख्य रूप से ग्लाइकोसोम के लिए स्थानीयकृत था। pHluorin2-PTS1 ग्लाइकोसोम के लिए स्थानीयकृत के साथ, हम BF ग्लाइकोसोम पीएच की जांच करने के लिए आगे बढ़े।

Figure 2
चित्रा 2: बीएसएफ ट्रिपैनोसोमा ब्रुसी में ग्लाइकोसोम के लिए pHluorin2-PTS1 का स्थानीयकरण। (ए) ग्लाइकोसोमल-निवासी प्रोटीन TbAldolase के साथ pHluorin2-PTS1 का स्थानीयकरण। BF 90-13 परजीवी pLEWpHluorin2-PTS1 के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किए गए थे और अभिव्यक्ति Doxycycline (1 μg/mL) के साथ प्रेरित किया गया था। TbAldolase को एंटी-TbAldolase सेरा का उपयोग करके स्थानीयकृत किया गया था, इसके बाद बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा फ्लोर 568 के साथ इनक्यूबेशन किया गया था। औसत पियर्सन का सहसंबंध गुणांक 0.895 (30 कोशिकाएं) था। (बी) बीएसएफ टी ब्रुसी में pHluorin2-PTS1 का अंशांकन। स्केल सलाखों = 4 माइक्रोन. संक्षिप्तीकरण: बीएसएफ = रक्तप्रवाह रूप। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

pHluorin2-PTS1 अंशांकन
पीएच में परिवर्तन pHluorin2-PTS1 के उत्तेजना स्पेक्ट्रम को बदल देता है। तटस्थ पीएच के तहत, 405 एनएम पर pHluorin2-PTS1 उत्तेजना 488 एनएम से अधिक है; पीएच गिर जाता है के रूप में, रिवर्ससच 9,21 है. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा ग्लाइकोसोम के सापेक्ष पीएच को मापने के लिए, हमने 405 एनएम लेजर (वीएल 2 चैनल) द्वारा उत्साहित होने पर उत्सर्जन को मापा और 488 एनएम लेजर (बीएल 1 चैनल) द्वारा उत्साहित होने पर उत्सर्जन को मापा, वीएल 2 / बीएल 1 (प्रतिदीप्ति अनुपात) के अनुपात का उपयोग करके सापेक्ष ग्लाइकोसोमल पीएच को मापने के लिए। प्रतिदीप्ति अनुपात को पीएच में बदलने के लिए, हमने प्रतिदीप्ति अनुपात खोजने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के बाद आयनोफोर वैलिनोमाइसिन और नाइजेरिसिन17,18 का उपयोग करके बाह्य पीएच के साथ इंट्रासेल्युलर और ग्लाइकोसोमल पीएच को संतुलित किया। जैसा कि अपेक्षित था, प्रतिदीप्ति अनुपात में वृद्धि हुई क्योंकि पीएच 6.5(चित्रा 2बी)के इंट्रासेल्युलरकेडी के साथ बाह्य पीएच में वृद्धि हुई। यह Kd pHluorin29 के इन विट्रो Kd में रिपोर्ट किए गए से थोड़ा कम था। दिलचस्प बात यह है कि ग्लूकोज की उपस्थिति में बीएसएफ ग्लाइकोसोमल पीएच ~ पीएच 8.0 था, जो ग्लूकोज22 की उपस्थिति में पीएफ ग्लाइकोसोम की तुलना में अधिक बुनियादी था। हम बाद के प्रयोगों में पीएच प्रतिदीप्ति अनुपात परिवर्तित करने के लिए इस अंशांकन वक्र का इस्तेमाल किया.

ग्लूकोज भुखमरी के कारण ग्लाइकोसोम अम्लीकरण
जबकि टी ब्रुसी पीएफ परजीवी ग्लूकोज22 के भूखे होने पर अपने ग्लाइकोसोम को अम्लीय करते हैं, बीएसएफ ग्लाइकोसोम ग्लूकोज का जवाब कैसे देते हैं यह अज्ञात है। इसका पता लगाने के लिए, हमने संस्कृति माध्यम को हटाने के लिए पीबीएस प्लस 10 एमएम ग्लूकोज में पीएचलुओरिन 2-पीटीएस 1 व्यक्त करने वाले बीएसएफ परजीवी को धोया और फिर ग्लूकोज के बिना पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया। इस गड़बड़ी के लिए सेंसर प्रतिक्रिया तुरंत मापा गया था और फिर प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा 1.5 घंटे के लिए उसके बाद हर 10 मिनट. प्रतिक्रियाओं पीबीएस प्लस 10 मिमी ग्लूकोज (संयुक्त राष्ट्र भूखा) में कोशिकाओं की तुलना में थे.

भुखमरी के जवाब में, हमने समय के साथ एक क्रमिक हल्के अम्लीकरण का अवलोकन किया, जो ~ 90 मिनट(चित्रा 3ए)से स्थिर हो गया। ग्लाइकोसोमल पीएच में यह परिवर्तन सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था (पी < 0.0001) और तीन अलग-अलग प्रयोगों में दोहराने योग्य। इससे पता चलता है कि बीएसएफ कोशिकाएं ग्लूकोज के भूखे होने पर अपने ग्लाइकोसोम को हल्के से अम्लीकृत करती हैं, पीएफ जीवन चरण9 में देखी गई प्रतिक्रिया के समान।

Figure 3
चित्रा 3: ग्लूकोज से वंचित होने पर बीएसएफ टी ब्रुसी के ग्लाइकोसोम का प्रतिवर्ती अम्लीकरण। (ए) ग्लूकोज की अनुपस्थिति (भूखा, नीला) या उपस्थिति (अन-भूखा, लाल) में उगाई गई कोशिकाओं का ग्लाइकोसोमल पीएच। भूखा कोशिकाओं ग्लूकोज ~ 2 मिनट के बिना पीबीएस में एक Attune NxT प्रवाह cytometer पर पहले माप से पहले निलंबित कर रहे थे. समय पाठ्यक्रम के तीन जैविक प्रतिकृतियां प्रदर्शन किए गए थे। संयुक्त राष्ट्र भूखे परजीवी पीबीएस प्लस 10 मिमी ग्लूकोज में ऊष्मायन थे. एक अप्रकाशित दो-पूंछ वाले छात्र का टी-टेस्ट भूखे और अन-भूखे 90 मिनट के समय अंक, *** पी = 0.0001 की तुलना में किया गया था। (बी) ग्लाइकोसोमल पीएच परिवर्तन का समय पाठ्यक्रम भूखा (नीला) और अन-भूखे (लाल) बीएसएफ परजीवी 10 एमएम ग्लूकोज के साथ 90 मिनट (हरी बिंदीदार रेखा) पर पुन: प्रस्तुत किया गया। समय पाठ्यक्रम के पांच जैविक प्रतिकृतियां प्रदर्शन किए गए थे। NS = महत्वपूर्ण नहीं है (p = 0.25, अयुग्मित दो-पूंछ वाले छात्र का t-परीक्षण)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

ग्लूकोज के जवाब में प्रतिवर्ती ग्लाइकोसोमल अम्लीकरण
हमने अगली बार परीक्षण किया कि क्या बीएसएफ ग्लाइकोसोम अम्लीकरण कोशिकाओं को भूखा रखकर और फिर ग्लूकोज को पुन: प्रस्तुत करके प्रतिवर्ती था। परजीवी 90 मिनट के लिए ग्लूकोज की अनुपस्थिति में ऊष्मायन थे. ग्लूकोज (10 मिमी) तो जोड़ा गया था और सेंसर प्रतिक्रिया एक और 90 मिनट (चित्रा 3 बी) के लिए साइटोमेट्री द्वारा मापा गया था. हमने देखा कि ग्लूकोज को पुन: पेश करने के बाद, ग्लाइकोसोमल पीएच ~ 30 मिनट में पूर्व-भुखमरी के स्तर पर लौट आया। इन परिणामों से पता चलता है कि बीएसएफ ग्लाइकोसोमल पीएच ग्लूकोज के जवाब में गतिशील और विनियमित है, पीएफ परजीवी में देखी गई पीएच प्रतिक्रिया के समान।

उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग के लिए pHluorin2 परख का अनुकूलन
ग्लाइकोसोम ट्रिपैनोसोम के लिए आवश्यक अंग हैं, क्योंकि वे प्रमुख चयापचय मार्गों को घर देते हैं। ग्लाइकोसोम के महत्व से पता चलता है कि उनके होमियोस्टेसिस के अवरोधक संभावित चिकित्सीय लीड के रूप में वादा कर सकते हैं। यहां, हमने ग्लाइकोसोमल पीएच के लिए परख को एक उच्च-थ्रूपुट प्रारूप में अनुकूलित किया है, जो ग्लाइकोसोमल पीएच के अवरोधकों की पहचान करने के लिए दवा स्क्रीन के अनुकूलन की अनुमति देगा। हम इस प्रतिक्रिया के विनियमन के विघटन का अनुमान परजीवी के लिए हानिकारक हो सकता है, ग्लाइकोसोम निवासी प्रोटीन समारोह7 पर पीएच के ज्ञात प्रभाव को देखते हुए.

उच्च-थ्रूपुट प्रारूप स्थापित करने के लिए, हमने परख मजबूती हासिल की। इसे पूरा करने के लिए, पीएचलुओरिन 2-पीटीएस 1 को व्यक्त करने के लिए प्रेरित परजीवी को 5 एमएम ग्लूकोज (उच्च नियंत्रण) या कोई ग्लूकोज (कम नियंत्रण) में 384-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेट में चढ़ाया गया था और फिर कमरे के तापमान पर 90 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया था। प्लेट तो प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया था. जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है, प्रतिकृति माप के बीच कम परिवर्तनशीलता थी और उच्च और निम्न नियंत्रण अच्छी तरह से अलग हो गए हैं, ऐसी विशेषताएं जिनके परिणामस्वरूप 0.645 का स्वीकार्य जेड-फैक्टर है। 0.5 > मूल्यों वाले परख को आम तौर पर उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग अभियानों के अनुकूलन के लिए पर्याप्त मजबूत माना जाता है। यहां सफलता को देखते हुए, हम आशा करते हैं कि इस सेंसर और दृष्टिकोण का उपयोग भविष्य के उच्च-थ्रूपुट ड्रग स्क्रीन में किया जाएगा।

Figure 4
चित्रा 4: भविष्य के एचटीएस अभियानों के लिए pHluorin2-PTS1 सेंसर-असर बीएसएफ की उपयुक्तता का आकलन करने के लिए परख। कोशिकाओं को ग्लूकोज (उच्च नियंत्रण, लाल, 5 मिमी ग्लूकोज) के साथ या हेक्सोज (कम नियंत्रण, नीला, कोई अतिरिक्त ग्लूकोज) के बिना 90 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया था। परिकलित Z-कारक 0.645 था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा S1: क्लोनिंग pHluorin2-PTS1 जीन में inducible T. brucei अभिव्यक्ति वेक्टर pLEW100v5. (ए) दोनों वैक्टर हिंदIII और बामहि द्वारा पचाए गए दोहरे प्रतिबंध थे और फिर शुद्ध किए गए थे। PHluorin2-PTS1 जीन के टुकड़े को T4 डीएनए लिगेज का उपयोग करके pLEW100v5 में लिगेट किया गया था। (बी) पीएलईडब्ल्यू 100-पीएचलॉरिन 2-पीटीएस 1। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा S2: PLEWpHluorin2-PTS1 के साथ ट्रांसफ़ेक्ट TbAldolase BF 90-13 परजीवी के साथ pHL का सहस्थानीयकरण। अभिव्यक्ति को डॉक्सीसाइक्लिन (1 माइक्रोग्राम / TbAldolase को एंटी-TbAldolase sera (ब्लॉक में पतला 1:500) का उपयोग करके स्थानीयकृत किया गया था, इसके बाद बकरी anG-खरगोश एलेक्सा फ्लोर 568 के साथ इनक्यूबेशन किया गया था। औसत पियर्सन का सहसंबंध गुणांक 0.895 (30 कोशिकाएं) था। स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा एस 3: एक उदाहरण के रूप में पीएच 8 अंशांकन बफर नमूना का उपयोग करके बीएसएफ पीएचएल सेंसर सेल-लाइन के अंशांकन के लिए प्रतिनिधि गेटिंग और डॉट प्लॉट । नमूने व्यवहार्यता डाई पीआई के साथ दाग दिए गए थे ताकि यह आकलन किया जा सके कि पीएच ने वाईएल 2-एच चैनल का उपयोग करके व्यवहार्यता को कैसे प्रभावित किया, लेकिन गेटिंग योजना में व्यवहार्यता का उपयोग नहीं किया गया था। एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए पर एक विस्तृत गेट का उपयोग कोशिकाओं के लिए गेट करने के लिए किया गया था क्योंकि अंशांकन में जीवित और मृत दोनों कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। कोशिकाओं के लिए गेटिंग के बाद, एकल कोशिकाओं (एकल) एफएससी-ए बनाम एफएससी-एच का उपयोग कर gated थे. अंतिम, बीएल 1-एच और वीएल 2-एच चैनलों में पीएचएल के लिए फ्लोरोसेंट घटनाओं के लिए एक कड़े गेट का उपयोग किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: बीएसएफ = रक्तप्रवाह रूप; पीआई = प्रोपिडियम आयोडाइड; FSC-A = आगे स्कैटर-पीक क्षेत्र; SSC-A = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र; FSC-H = आगे स्कैटर-पीक ऊंचाई। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 4: ग्लूकोज भुखमरी और ऐड-बैक टाइम कोर्स परख के लिए प्रतिनिधि गेटिंग और डॉट प्लॉट । भूखे 0 मिनट के नमूने का उपयोग एक उदाहरण के रूप में किया जाता है। पीआई का उपयोग करने के बाद से लाइव कोशिकाओं को वाईएल 2-एच चैनल पर गेट किया गया था। मलबे और समुच्चय को बाहर करने के लिए एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए का उपयोग करके कोशिकाओं को गेट किया गया था। FSC-A बनाम FSC-H का उपयोग करके सिंगलेट्स को गेट किया गया था। चैनल BL1-H और VL2-H का उपयोग pHL+ इवेंट्स के लिए गेट करने के लिए किया गया था। इस गेट को सेट करते समय ऑटो-फ्लोरोसेंट घटनाओं को बाहर करने के लिए एक डब्ल्यूटी नियंत्रण का उपयोग किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: पीआई = प्रोपिडियम आयोडाइड; FSC-A = आगे स्कैटर-पीक क्षेत्र; SSC-A = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 1: प्रवाह साइटोमेट्री के लिए उपयोग किए जाने वाले चैनल और सामान्य नाम। चैनल का नाम, सामान्य नाम और उपयोग किए जाने वाले लेजर और उत्सर्जन फ़िल्टर प्रदान किए जाते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका S2: विभिन्न पीएच बफ़र्स में नाइजेरिसिन और वैलिनोमाइसिन का उपयोग करके पीएचएल अंशांकन से परिणाम। इस तालिका में .fcs फ़ाइलों के FlowJo विश्लेषण से निर्यात किए गए आँकड़े शामिल हैं। इन मूल्यों का उपयोग पीएचएल को कैलिब्रेट करने के लिए प्रतिदीप्ति अनुपात (वीएल 2-एच / बीएल 1-एच) को खोजने के लिए किया गया था, जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है। इन पीएच अंशांकन परिणामों का उपयोग ग्लूकोज भुखमरी और ऐड-बैक टाइम-कोर्स प्रयोगों(चित्रा 3)के लिए पीएच को प्रक्षेपित करने के लिए भी किया गया था। गुणवत्ता नियंत्रण के लिए निम्न आँकड़ों का उपयोग किया गया था: कुल ईवेंट गणना, pHL+ गणना, PI- (%), PI+ (%), और pHL+ (%). प्रत्येक जैविक प्रतिकृति के लिए डेटा एक अलग टैब में है, और "सारांशित परिणाम" लेबल टैब में प्रत्येक पीएच उपचार के लिए प्रतिदीप्ति अनुपात होता है और दोहराना होता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 3: चित्रा 3 ए में प्रस्तुत बीएसएफ पीएचएल ग्लूकोज भुखमरी समय-पाठ्यक्रम परख से डेटा का विश्लेषण किया। इस तालिका में FlowJo सॉफ़्टवेयर में विश्लेषण की गई .fcs फ़ाइलों से निर्यात किए गए आँकड़े शामिल हैं। प्रतिदीप्ति अनुपात की गणना माध्यिका VL2-H और माध्यिका BL1-H (दोनों pHL+ जनसंख्या से) के अनुपात को लेकर की गई थी। इन अनुपातों को "सारांशित परिणाम" लेबल वाले टैब में संकलित किया गया था। पीआई- (%) का उपयोग समय के साथ व्यवहार्यता पर ग्लूकोज भुखमरी के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए किया गया था। गुणवत्ता नियंत्रण के लिए कुल गिनती और पीएचएल + गिनती का उपयोग किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 4: चित्रा 3 बी में प्रस्तुत बीएसएफ पीएचएल ग्लूकोज ऐड-बैक टाइम-कोर्स परख से डेटा का विश्लेषण किया। इस तालिका में FlowJo सॉफ़्टवेयर में विश्लेषण की गई .fcs फ़ाइलों से निर्यात किए गए आँकड़े हैं। pHL+ माध्यिका VL2/BL1 मानों की गणना pHL+ माध्यिका VL2-H और BL1-H से Excel में की गई थी। अन्य आंकड़ों का उपयोग गुणवत्ता नियंत्रण के लिए किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 5: पीएचएल का उपयोग करके जेड-फैक्टर परीक्षण उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग परख के फ्लोजो विश्लेषण से परिणामी डेटा। "0 मिमी ग्लूकोज" (कम) और "5 मिमी ग्लूकोज" (उच्च) लेबल वाले टैब में क्रमशः 0 या 5 मिमी ग्लूकोज के साथ इलाज की गई कोशिकाओं से डेटा शामिल है। इन प्रतिदीप्ति अनुपात चित्रा 4 में प्रस्तुत कर रहे हैं. "पूल्ड विश्लेषण" टैब में, दोनों उपचारों के लिए प्रतिदीप्ति अनुपात संकलित किए गए थे और प्रत्येक के लिए नमूना (एसडी) के माध्य और मानक विचलन की गणना की गई थी। जेड-कारक आँकड़े की गणना समीकरण 3 का उपयोग करके की गई थी। साधनों के पृथक्करण को मापने के लिए माध्य उच्च/निम्न के अनुपात की गणना की गई थी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

अफ्रीकी ट्रिपैनोसोम में पर्यावरण की धारणा और प्रतिक्रिया तंत्र को खराब समझा जाता है। पोषक तत्वों की उपलब्धता में परिवर्तन परजीवी में विविध प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करने के लिए जाना जाता है, जिसमें ग्लाइकोसोम का अम्लीकरण भी शामिल है। यहां, हमने एक हेरिटेबल प्रोटीन सेंसर, पीएच 2 और फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं में पर्यावरणीय गड़बड़ी के लिए ग्लाइकोसोमल पीएच प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक विधि का वर्णन किया है।

सेंसर के उपयोग में कई महत्वपूर्ण चरण हैं। सबसे पहले, ट्रांसफ़ेक्ट परजीवी का लक्षण वर्णन जो ट्रांसजीन को व्यक्त करता है, महत्वपूर्ण है, क्योंकि अभिव्यक्ति में सेल-टू-सेल भिन्नता हो सकती है। कुछ ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति का स्तर समय के साथ गिर सकता है। हालांकि यह आज तक pHluorin2-असर कोशिकाओं के साथ नहीं देखा गया है, अगर सेंसर जवाबदेही अत्यधिक परिवर्तनशील हो जाती है (उदाहरण के लिए, प्रेरण के बाद, सेंसर सिग्नल मजबूत नहीं है), तो संस्कृति को क्लोन करना आवश्यक हो सकता है, क्योंकि कुछ सदस्य आबादी दूसरों की तुलना में उच्च स्तर पर प्रोटीन व्यक्त कर सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, पुन: परिवर्तन और चयन उच्च (यद्यपि संभवतः क्षणिक) अभिव्यक्ति के साथ नई सेल लाइनों को उत्पन्न करने के लिए उपयोगी साबित हुए हैं। यदि पुन: अभिकर्मक की आवश्यकता है, तो हम अलग-अलग लाइनों को क्लोन करने की सलाह देते हैं, क्योंकि ब्याज के ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति समय के साथ आबादी में उच्च अभिव्यक्तियों के नुकसान के लिए एक सूक्ष्म विकास नुकसान प्रदान कर सकती है।

इसके अतिरिक्त, परजीवी व्यवहार्यता की निगरानी करना आवश्यक है-दोनों परख के दौरान और नियमित रूप से संस्कृतियों को बनाए रखते हुए। हमने परख के दौरान इस उद्देश्य के लिए या तो पीआई या थियाज़ोल लाल को शामिल किया है, और ये रिपोर्टर यह सुनिश्चित करते हैं कि डेटा केवल जीवित कोशिकाओं में प्रतिक्रियाओं को दर्शाता है। यह सुनिश्चित करना कि सामान्य संस्कृति के दौरान सेल दोहरीकरण का समय स्थिर है, विशेष रूप से बड़े पैमाने पर परख (जैसे, एचटीएस-प्रकार परख) की दीक्षा से पहले उन कोशिकाओं के साथ परख शुरू करने के बारे में चिंता को सीमित करता है जो संपन्न नहीं हैं, जो नकारात्मक रूप से उच्च और निम्न नियंत्रण संकेतों को बदल सकते हैं और स्क्रीन की समग्र मजबूती को प्रभावित कर सकते हैं।

ग्लाइकोसोमल पीएच को मापने के लिए हमने यहां जिस दृष्टिकोण का वर्णन किया है वह मजबूत और संवेदनशील है। हालांकि, दृष्टिकोण की सीमाएं हैं। सबसे पहले, माइक्रोटिटर प्लेटों को स्वीकार करने में सक्षम नमूनों सहित उपयुक्त क्षमताओं वाले साइटोमीटर तक पहुंच की आवश्यकता होती है। जबकि अनुपातमितीय डेटा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा एकत्र किया जा सकता है, इस तरह से विश्लेषण किया जा सकता है कि नमूनों की सीमित संख्या स्क्रीन (और समय पाठ्यक्रम आधारित परख) जैसे दृष्टिकोण की उपयोगिता को सीमित करती है।

एक दूसरी संभावित सीमा यह है कि परख में जैव सुरक्षा चिंता का एक एजेंट शामिल है। यह संभव है कि काम के लिए आवश्यक उपकरणों को रखने वाली मुख्य सुविधाएं अपने उपकरणों पर जीवित परजीवियों की अनुमति नहीं दे सकती हैं। ट्रांसजेनिक ट्रिपैनोसोम को उत्पन्न करने और बनाए रखने की तकनीकी चुनौतियों के साथ-साथ इन सीमाओं को परजीवी जीव विज्ञान और सेल विश्लेषण में उपयुक्त विशेषज्ञता वाले समूहों के बीच सहयोग के माध्यम से दूर किया जा सकता है।

यहां वर्णित कार्य अफ्रीकी ट्रिपैनोसोम में ग्लाइकोसोमल पीएच सेंसर का उपयोग करने पर केंद्रित है, लेकिन उपकरण को अन्य कीनेटोप्लास्टिड परजीवियों में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि यह स्पष्ट नहीं है कि लीशमैनिया एसपीपी के जीव विज्ञान में ऑर्गेनेल की क्या भूमिका हो सकती है।या ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी, क्या यह संभव है कि पीएचएलयूओरिन 2-पीटीएस 1 को कोशिकाओं में एक ट्रांसजीन के रूप में व्यक्त किया जा सकता है, यह देखते हुए कि परजीवी-विशिष्ट अभिव्यक्ति वैक्टर उपलब्ध हैं और ग्लाइकोसोमल आयात मशीनरीजीवों 5,23,24में समान है।

सेंसर-असर कोशिकाओं का एक संभावित अनुप्रयोग छोटे अणुओं की पहचान है जो ग्लाइकोसोम को अम्लीय करने के लिए सेलुलर क्षमता को बदलते हैं। ये संभवतः परजीवी के लिए हानिकारक होंगे, क्योंकि परिवर्तित पीएच हेक्सोकाइनेज के नियमन का एक संभावित साधन पाया गया है, एक ग्लाइकोसोम-निवासी प्रोटीन जो अफ्रीकी ट्रिपैनोसोम7 के रोगजनक जीवन चक्र चरण में आवश्यक है। यहाँ वर्णित परख इस गतिविधि के लिए बड़े रासायनिक संग्रह की पूछताछ की अनुमति देता है, उच्च throughput (चित्रा 4) होने के लिए अनुकूलित किया गया है.

संक्षेप में, यह उपकरण परजीवी-विशिष्ट ऑर्गेनेल में गतिशील प्रतिक्रियाओं में शामिल तंत्र को विच्छेदन करने का अवसर प्रदान करता है। आगे और रिवर्स आनुवंशिकी के साथ संयोजन में सेंसर लाइनों का उपयोग करना, यह संभावना है कि अद्वितीय परजीवी-विशिष्ट मार्गों की पहचान की जाएगी। इसके अलावा, सेंसर लाइनें प्रतिक्रिया के छोटे अणु अवरोधकों की पहचान के लिए अवसर प्रदान करती हैं, नई दवा लक्ष्य खोज के लिए द्वार खोलती हैं।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

pHluorin2-PTS1 को ट्विस्ट बायोसाइंस द्वारा pLEW100v5 में क्लोन किया गया था, जिसने एक उच्च-कॉपी क्लोनिंग वेक्टर में निर्माण प्रदान किया था; pLEW100v5 डॉ जॉर्ज क्रॉस से एक उपहार था। टी. ब्रुसी एल्डोलेज़ के खिलाफ उठाया गया एंटीसेरम अनुरोध पर डॉ. मेरेडिथ टी. मॉरिस, क्लेम्सन विश्वविद्यालय से उपलब्ध है। जेसीएम और केएसी प्रयोगशालाओं के काम को आंशिक रूप से राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01AI156382) के एक पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था। एसएसपी को एनआईएच 3R01AI156382 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile) VWR 10861-572
75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile) Corning 431464U
80 µL flat-bottom 384-well plate BrandTech  781620
Amaxa Human T Cell Nucleofector  Kit Lonza VPA-1002
Attune NxT Flow Cytometer invitrogen by Thermo Fisher Scientific A24858 FlowJo software
BRANDplates 96-Well, flat bottom plate Millipore Sigma BR781662
Coloc 2 plugin of ImageJ https://imagej.net/plugins/coloc-2
CytKick Max Auto Sampler invitrogen by Thermo Fisher Scientific A42973
CytoFLEX Flow Cytometer Beckman-Coulter
Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule Fisher Scientific 50-980-487
GraphPad Prism statistical software
Nigericin (sodium salt) Cayman Chemical 11437
Nucleofector 2b Lonza Discontinued Product
OP2 Liquid Handler opentrons OP2
poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O Sigma Life Science CAS:25988-63-0 Pipetting robot for HTS assay
Thiazole Red (TO-PRO-3) biotium #40087 We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler
valinomycin Cayman Chemical 10009152 Pipetting robot for HTS assay
         For pH calibration
         For pH calibration

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References

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गतिशील ग्लाइकोसोमल पीएच को मापना: लिविंग <i>ट्रिपैनोसोमा ब्रुसी</i> में परिवर्तन
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Call, D., Pizarro, S. S., Tovey, E., Knight, E., Baumgardner, C., Christensen, K. A., Morris, J. C. Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (203), e66279, doi:10.3791/66279 (2024).

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