Måling af dynamiske glykosomale pH-ændringer i levende trypanosoma brucei

Parasitiske kinetoplastider, som de fleste levende organismer, er afhængige af glukose som en grundlæggende bestanddel af central kulstofmetabolisme. Denne gruppe omfatter medicinsk vigtige organismer, såsom det afrikanske trypanosom, Trypanosoma brucei; det amerikanske trypanosom, T. cruzi; og parasitter af slægten Leishmania. Glukosemetabolisme er afgørende for parasitvækst i de patogene livscyklusstadier. For eksempel, når det fratages glukose, dør blodbaneformen (BSF) af det afrikanske trypanosom hurtigt. Især tjener glykolyse som den eneste kilde til ATP i dette infektionsstadium¹. Leishmania-parasitter er ligeledes afhængige af glukose i den menneskelige vært, med amastigote-livscyklusstadiet, der ligger i værtsmakrofager, afhængig af denne kulstofkilde til vækst².

Mens disse parasitter har forskellige livsstile, der involverer forskellige insektvektorer, deler de mange fællestræk i, hvordan de reagerer på og forbruger glukose. For eksempel lokaliserer disse parasitter de fleste glykolytiske enzymer i modificerede peroxisomer kaldet glycosomer. Denne kinetoplastidspecifikke organel er relateret til pattedyrperoxisomer baseret på konserverede biosyntetiske mekanismer og morfologi 3,4,5,6.

Opdelingen af de fleste af de glykolytiske vejenzymer i glycosomet tilbyder parasitspecifikke midler til regulering af vejen. Ved hjælp af en kemisk pH-sonde fastslog vi, at næringsstofmangel udløser en hurtig forsuring af procykliske form (PF) parasitglycosomer, der resulterer i ændret glykolytisk enzymaktivitet gennem eksponering af et allosterisk regulatorbindingssted på det vigtigste glykolytiske enzym hexokinase ^7,8. I vores tidligere arbejde krævede den kemiske sonde konstant levering til brug, hvilket begrænsede dens anvendelighed i andre applikationer. Derudover begrænsede udfordringer med at opretholde sondefordelingen i glykosomet i BSF nytten af tilgangen til undersøgelse af glykosomal pH i dette livsstadium.

I denne undersøgelse har vi brugt biosensoren pHluorin2 med fluorescerende protein til at overvåge glykosomal pH-ændring i BSF T. brucei som reaktion på miljømæssige signaler, herunder glukosesult⁹ (figur 1). Resultaterne fra dette arbejde tyder på, at BSF T. brucei syrer glycosomer hurtigt som reaktion på sult på en reversibel måde, svarende til reaktioner, vi har observeret i PF-parasitter. Vi forventer, at denne biosensor vil forbedre vores forståelse af glykolytisk regulering i T. brucei og relaterede parasitter.

Brug af T. brucei brucei 90-13 BSF trypanosomer, en monomorf parasitlinje, kræver overvejelse af sikkerhed, da de betragtes som risikogruppe 2-organismer, der skal håndteres i biosikkerhedsniveau 2-faciliteter.

1. Trypanosomkultur og transfektion

1. Kultur T. brucei brucei 90-13 BSF trypanosomer i HMI-9 medium suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS og 10% Nu-Serum ved 37 °C i 5% CO₂¹⁰.
   BEMÆRK: For at holde kulturen sund skal du opretholde celletætheden mellem 2 × 10⁴ og 5 × 10⁶ celler / ml.
2. Kloning af pHluorin2-PTS1 til pLEW100v5
   1. Syntetiser pHluorin2 åben læseramme kommercielt for at give genet med en 3' forlængelse, der koder for en to glycinlinker efterfulgt af tripeptidet AKL, et PTS1-lokaliseringsmærke.
   2. Klon denne konstruktion ind i den inducerbare trypanosomekspressionsvektor pLEW100v5 ved restriktionsfordøjelse. Dobbeltfordøje både kloningsvektoren indeholdende pHluorin2-PTS1 og pLEW100v5 ved hjælp af HindIII og BamHI¹¹. Udfør et oprydningstrin, helst ved agarosegelrensning, for at fjerne restriktionsenzymer, den uønskede kloningsvektorrygrad og det udskårne luciferase-genholdige fragment.
   3. Ligate pHluorin2-bærende indsats i fordøjet pLEW100v5 med T4 DNA Ligase¹². (se supplerende figur S1 for en ordning for kloning).
3. Sekvenser plasmidet ved næste generations helplasmidsekventering for at verificere, at insertet og vektoren er ligeret korrekt, og at der ikke indføres mutationer inden for pHluorin2-PTS1-genet under kloningsprocessen.
   BEMÆRK: Den komplette plasmidsekvens er blevet indsendt til Addgene.org og er blevet tildelt #83680.
4. Linearisere 20 μg plasmidet ved at fordøje med 40 enheder NotI; transfekteres derefter til BSF 90-13 parasitter via nukleofektion ved hjælp af det refererede humane T-cellesæt (se materialetabel). Vælg for stabil integration som beskrevet af Burkard et ^al.13.

2. Immunofluorescens colokalisering af pHlourin2-PTS1

1. Forbered mikroskopi dias ved at behandle dem med poly-L-lysin 0,1% (w / v) i H₂O i 10 min. Efter fjernelse af poly-L-lysinopløsningen vaskes objektglasset en gang med PBS.
2. For at inducere pHluorin2-PTS1-ekspression behandles celler ved 2 × 10⁵ celler/ml med tetracyklin eller doxycyclin (1 μg/ml) 24 timer før høst. Pellet 2 × 10⁶ forældreparasitter og inducerede pLEWpHluorin2-PTS1 (pHL) parasitter ved centrifugering (stuetemperatur [RT], 10 min, 1.000 × g) og vaskes en gang med PBS.
3. Resuspender cellerne i 200 μL frisklavet 2% paraformaldehyd i PBS fremstillet af kommercielt leveret 16% EM-opløsning. Påfør cellerne i fikseringsmidlet på diaset, og lad cellerne sætte sig i 30 minutter. De klæbende celler vaskes 2x med vaskeopløsning (0,1% normalt gedeserum i PBS).
4. Påfør permeabiliseringsopløsningen (0,5% Triton X-100 i PBS) på cellerne og inkuber i nøjagtigt 30 minutter. Fjern permeabiliseringsopløsningen og vask en gang med rigelige mængder vaskeopløsning.
5. Påfør blokopløsningen (10% normalt gedeserum og 0,1% Triton X-100 i PBS) og inkuber i 30 minutter.
6. Fortynd antisera hævet mod T. brucei aldolase 1:500 i blokopløsning og påfør den på cellerne¹⁴. Inkuber i 1 time ved RT. Vask diasene i 5x i 3-5 min min med vaskeopløsning.
7. Fortynd ged anti-kanin Alexa fluor 568 1:1.000 i blokopløsning og påfør cellerne. Inkuber i 1 time ved RT. Vask diasene i 5x i 3-5 minutter med vaskeopløsning.
8. Påfør monteringsmediet, og forsegl et dæksel på diaset.
9. Afbild cellerne med et 100x mål (NA 1.4-0.7), og analyser billederne ved hjælp af ImageJ. Udfør Pearsons colokaliseringsanalyse ved hjælp af plug-in'et 'Coloc 2' til ImageJ. Se supplerende figur S2 for et felt med repræsentative celler. )
   1. For at fuldføre dette skal du tilføje billedfilen til Fiji og vælge Billeder.
   2. Juster lysstyrke og kontrast for hver kanal til et punkt, hvor ingen baggrund er synlig.
   3. Skift billeder fra 16-bit til 8-bit, flet billederne, og beskær derefter til en enkelt celle med opdelte kanaler.
   4. Under Analysér og samlokalisering skal du vælge Coloc2-plugin'et. Vælg aldolase (den røde kanal) som kanal 1 og pHL (den grønne kanal) som kanal 2 , og klik på okay for at starte beregningen af Pearsons korrelation.

3. Prøveforberedelse til flowcytometri

1. Inducer pHL-celler med enten tetracyklin eller doxycyclin (1 μg/ml) natten over.
2. Pellet cellerne (~ 4 × 10⁷ pHL og ~ 1 × 10⁶ forældre) ved centrifugering (RT, 10 min, 1.000 × g). Supernatanten fjernes og cellerne resuspenderes i 1 ml PBS enten med eller uden 10 mM glucose, afhængigt af om prøven er udsultet eller ikke-sultet. Til tidsforløbsanalyser resuspenderes i PBS suppleret med 10 mM glucose for at forhindre cellerne i at sulte, indtil vasken er afsluttet. Til HTS-assayet (high-throughput screen) resuspenderes i PBS uden glukose for at minimere overførsel af glucose; Gentag vaskerne to gange mere.
3. Cellerne centrifugeres for fjerde gang, supernatanten fjernes, og cellepelleten resuspenderes i enten PBS, PBS plus 5 mM glucose eller PBS plus 10 mM glucose afhængigt af behandlingen. Prøverne suppleres med enten 1 μg/ml propidiumiodid (PI) eller 100 nM thiazolrød (TR) til bestemmelse af levende/døde. Hver prøve overføres til 5 ml rør, der er kompatible med flowcytometeret.

4. Flowcytometri

BEMÆRK: Forbered eksperimentet på et flowcytometer, der indeholder følgende lasere: 405 nm (violet), 488 nm (blå) og 561 nm (gul) eller 638 nm (rød). Se supplerende tabel S1 for almindelige navne for kanaler, der er beskrevet nedenfor.

1. For at måle pHL-fluorescens skal du bruge kanalerne KO525 (VL2-H, excitation 405 nm, emission 542/27 nm) og FITC (BL1-H, excitation 488 nm, emission 530/30 nm). For at skelne levende celler fra døde celler skal du bruge enten PI eller TR; måle PI på YL2-H-kanalen (excitation 561 nm, emission 620/25 nm). Mål TR på RL1-H-kanalen (638 nm excitation, 660/10 BP).
   1. For at konfigurere eksperimentet på flowcytometersoftwaren skal du oprette følgende plot: 1) YL2-H-kanalhistogram (hvis du bruger PI) eller et RL1-H-kanalhistogram (hvis du bruger TR), 2) FSC-A vs SSC-A dotplot, 3) FSC-A vs FSC-H dot plot og 4) BL1-H vs VL2-H kanal dot plot.
   2. Placer først den ufarvede WT-kontrol (forældrecellelinje) på prøveinjektionsporten (SIP), og løft trinnet på plads. Begynd at indsamle data på cytometeret ved den laveste strømningshastighed for at give tid til at foretage de nødvendige justeringer. For at undgå at score falske snavs og døde celler skal du begynde at registrere begivenheder 5 sekunder efter, at prøvetagningen begynder.
   3. Juster YL2- eller RL1-spændingen, så hovedtoppen er inden for 10^{3-10 4} relative fluorescensintensitetsenheder (RFI). Juster FSC- og SSC-spændinger, så >90% af hændelserne passer på prikplottet. Juster FSC-tærsklen for at udelukke affaldspopulationen, men ikke sandsynlige celler.
   4. Juster VL2- og BL1-kanalerne, så den primære top er inden for 10 3-10⁴ RFI-enheder til den ubejdsede WT-styring.
   5. Anbring den første prøve, der indeholder induceret pHL farvet med enten PI eller TR, på SIP'en, og løft trinnet på plads. Begynd at hente data med den laveste strømningshastighed, og observer omhyggeligt begivenheder i hvert plot. Sørg for>90% af begivenhederne er inden for hvert plot, og at ingen begivenheder mætter VL2-H- og BL1-H-kanalerne.
2. Fortsæt med at køre prøverne. Sørg for at registrere mindst 10.000 hændelser pr. prøve.
3. Gem dataene fra eksemplerne i .fcs-filformat, og eksportér dem til analyse.

5. Dataanalyse af flowcytometriresultater

BEMÆRK: Denne dataanalysearbejdsgang bruger FlowJo-software. Hvis der anvendes anden flowcytometrianalysesoftware, skal du fortsætte med at følge de vigtigste trin, der er beskrevet nedenfor, ved hjælp af software-passende værktøjer. For at visualisere plottene og gating, se supplerende figur S3 og supplerende figur S4.

1. Åbn et nyt layout, og åbn de .fcs-filer, der blev hentet i trin 4.3. Træk og slip .fcs-filerne i layoutvinduet.
2. Port til levende celler.
   1. Dobbeltklik på det ubejdsede WT-kontrolelement for at åbne et vindue til dette eksempel.
   2. Få vist dataene som et histogram på enten YL2-H-kanalen (hvis du bruger PI) eller RL2-H-kanalen (hvis du bruger TR). Skift mellem dette og prøver farvet med levedygtighedsfarvestoffet for at identificere de levende og døde populationer.
      BEMÆRK: Alle hændelser skal være ubefarvede, da der ikke blev tilsat et levedygtighedsfarvestof til denne prøve.
   3. Opret en bisektorport, der deler de levende og døde befolkninger; navngiv venstre port Live og højre port Død. Anvend denne port på alle prøver, og skift derefter mellem prøver for at sikre, at denne port trækkes korrekt for alle prøver. Juster porten efter behov.
3. Port til cellerne.
   1. På det ubesmittede WT-kontrolelement skal du dobbeltklikke på Live gate for at se begivenheder i den gate. Skift punktplottet x-aksen til FSC-A og y-aksen til SSC-A.
   2. Brug polygonportværktøjet til at tegne en port rundt om cellepopulationen, og navngiv den Celler. Sørg for at udelukke snavs/døende celler (typisk yderst til venstre og nederst i prikplottet) og aggregater (yderst til højre og øverst i prikplottet).
   3. Anvend denne port under Live gate for alle prøver. Skift mellem prøver for at sikre, at porten omfatter den sandsynlige cellepopulation for alle prøver, og foretag de nødvendige justeringer. Sørg for at genanvende porten på alle prøver efter at have ændret den.
      BEMÆRK: Cellepopulationsfordelingen ændres mærkbart mellem sultede og ikke-sultede forhold på FSC vs SSC; sikre, at celleporten omfatter cellepopulationen under alle forhold.
4. Gate til enkeltceller for at øge kvaliteten af pH-målinger.
   1. På det ubejdsede WT-kontrolelement skal du dobbeltklikke på celleporten for at få vist hændelser i den pågældende port. Skift punktplottet x-aksen til FSC-A og y-aksen til FSC-H.
   2. Se efter en diagonal fordeling af enkeltceller på dette prikplot med dubletter, der danner en sekundær population nederst til højre for singletpopulationen (se supplerende figur S1 tredje plot). Brug polygonportværktøjet til at tegne en port omkring singlet-begivenhederne eksklusive dubletpopulationen. Navngiv denne port Singlets.
   3. Anvend Singlets-porten under celleporten for alle prøver. Skift igen mellem prøver for at sikre, at porten korrekt udelukker dubletpopulationen, mens du inkluderer singletpopulationen. Juster efter behov.
5. Port til fluorescerende pHL-celler.
   1. På den ubejdsede WT-kontrolprøve skal du dobbeltklikke på Singlets-porten for at åbne et prikplot for den pågældende population. Skift x-aksen til BL1-H og y-aksen til VL2-H.
   2. pH-sensoren pHluorin2 er fluorescerende i både VL2 og BL1. Brug polygonportværktøjet til at tegne en diagonalformet port, der strækker sig til toppen og højre væk fra den autofluorescerende population nederst til venstre i prikplottet. Navngiv denne gate pHL+.
   3. Anvend pHL+ -porten under Singlets-porten for alle prøver. Skift til en pHL-prøve, og juster porten til at inkludere hændelser med større fluorescensintensitet i både VL2-H og BL1-H end WT-kontrollen. Sørg for, at denne port omfatter denne fluorescerende population for alle prøver, da placeringen af denne population vil ændre sig, når glykosomal pH ændres.
      BEMÆRK: Dette lille, men synlige skift i pHL+ populationen skyldes pH-afhængige ændringer i fluoroforens excitationsspektrum.
6. Eksportér statistikken.
   1. Klik på Table Editor | Rediger bjælke | Tilføj kolonne for at tilføje nye statistikker, der skal eksporteres.
      BEMÆRK: For hver statistik, der skal eksporteres, skal du vælge den respektive statistik, og hvilken population den skal eksporteres fra. Sørg for at vælge den relevante parameter for gældende statistik såsom Median. Lad prøven være uændret.
   2. Tilføj kolonner med følgende statistikker: Samlet antal (ungated), pHL+ Count, Live Freq. af Total (procentdel baseret på samlede hændelser), pHL+ Freq. af Parent (procentdel baseret på overordnet gate), pHL+ Median VL2-H og pHL+ Median BL1-H.
   3. Klik på tabeleditoren , og skift følgende eksportindstillinger: Vis til fil og tekst til CSV , og vælg derefter fildestination og navn. Klik på Opret tabel.
7. Beregn fluorescensforholdet.
   1. Gem den eksporterede .csv fil som en regnearksfil.
   2. Udfør kvalitetskontrolanalyse ved at sammenligne følgende på tværs af alle prøver i eksperimentet: antal hændelser pr. prøve, procentdel af livehændelser og procentdel af pHL+-hændelser. Sammenlign disse visuelt i søjle- eller punktdiagrammer afhængigt af eksperimentet.
   3. Mærk en ny kolonne som pHL+ Median VL2/BL1. For hver prøve divideres medianen VL2-H-værdien med medianen BL1-H-værdien som vist i ligning (1).
      (1)
8. Brug statistisk analysesoftware til at udføre statistisk analyse ved hjælp af fluorescensforholdet.

6. Kalibrering af pH-biosensor

BEMÆRK: For at konvertere målte fluorescensforhold til pH-enheder, kalibrer pHL-ekspressive celler ved hjælp af nigericin og valinomycin. Nigericin er en K ⁺ / H ⁺ antiporter, en ionofor, der kan ekvilibrere pH over membraner, når der er tilstrækkelig K ⁺ i bufferen¹⁵. Nigericin har været almindeligt anvendt til at kalibrere pHluorin og andre pH-sensorer^16,17. Da peroxisomalt lokaliseret pHluorin tidligere blev kalibreret ved hjælp af 10 μM nigericin¹⁸, valgte vi at behandle med denne koncentration. Valinomycin er en kaliumionofor og er blevet anvendt (ved 4 μM) til at afbalancere pH over mitokondriemembraner¹⁹. Vi brugte 10 μM valinomycin til at hjælpe nigericins pH-ligevægtsaktivitet ved at sikre, at K + ioner blev ekvilibreret over membranerne. Mens vi brugte en nigericin-valinomycin kombination, nigericin kan være tilstrækkelig til at ligevægte organellar pH.

1. Forbered otte opløsninger af universel kalibreringsbuffer (UCB; 15 mM MES, 15 mM HEPES og 130 mM KCl) hver ved en anden pH-værdi fra 5 til 8,5.
2. Centrifuge (RT, 10 min, 800-1.000 × g) otte separate rør med 2 ml pHL-ekspressiv BSF-kultur (~4 × 10⁶ celler hver).
3. Supernatanten fjernes, og hver cellepellet resuspenderes derefter i UCB ved forskellige pH-værdier.
4. Indfør nigericin og valinomycin, hver til 10 μM. Spike i PI til 1 μg / ml.
5. Inkuber cellerne i hver opløsning i 15 min.
6. Kør hver prøve på et flowcytometer for at måle fluorescensforholdet som beskrevet i trin 4-5.
7. Gentag dette eksperiment to gange mere for at opnå tre biologiske replikater for hver pH-værdi. Eksportér data i .fcs-format.
8. Analysér .fcs-filerne som beskrevet i trin 5.1 til 5.8. Brug det målte fluorescensforhold for hver pH til at interpolere glycosomal pH i fremtidige eksperimenter ved hjælp af ligning (2).
   (2)
   BEMÆRK: Supplerende figur S3 viser prikplottene og gating-skemaet. Resultaterne findes i supplerende tabel S2. Følgende beskriver, hvordan man interpolerer pH fra fluorescensforhold ved hjælp af GraphPad Prisme. Hvis du bruger anden statistisk software, skal du følge de samme vigtige trin.
   1. Åbn GraphPad-prisme, og opret en XY-tabel med tre y-replikater. Indsæt pH-værdierne i x-kolonnen og deres tilknyttede fluorescensforholdsværdier i de y-replikate kolonner.
   2. Klik på grafen, der er knyttet til tabellen. Når du ser grafen, skal du klikke på Analysér under båndet Analyse | Interpolere en standardkurve under XY-analyser.
   3. Vælg Sigmoidal, 4PL, X er log (koncentration), da pH-enheder er på en logaritmisk skala. Top- og bundparametrene er de estimerede top- og bundplateauer. Vælg Ingen særlig håndtering af afvigende værdier.
      BEMÆRK: Softwaren vil forsøge at tilpasse dataene til den model, der er beskrevet i ligning (2) og trin 6.9.3. Se efter tegn på manglende tilpasning i resultattabellen og kurven på grafen.
   4. For at interpolere pH fra fluorescensforhold i andre eksperimenter skal du gå til tabellen med pHL-kalibreringsdataene. Indsæt værdierne for fluorescensforholdet under kalibreringsdataene i y-kolonnen/-kolonnerne. Giv hver y-værdi en titel, men lad x-værdien (pH) være tom, da den er ukendt.
   5. I galleriet Resultater skal du klikke på interpolationsanalysen og derefter gå til fanen Interpolerede X-replikater . Se efter de interpolerede pH-værdier, der vises sammen med de indtastede fluorescensforholdsværdier.
      BEMÆRK: Softwaren bruger modellen og de bedst egnede parameterværdier, der findes fra kalibreringsdataene, til at interpolere pH fra fluorescensforhold til eksperimenter, hvor pH er ukendt.

7. Glukosesult og addback-tidskurser

1. Der induceres 15 ml BSF pHL-parasitter natten over med 1 μg/ml doxycyclin inkuberet ved 37 °C som beskrevet i trin 1.1.
2. Der vaskes 15 ml induceret pHL-kultur i PBS suppleret med 10 mM glucose. Gentag dette trin 3x.
   1. Samtidig vaskes 3 ml WT-kultur i PBS 3x som beskrevet i trin 3.2.
   2. Efter den første vask, når pHL-prøven er resuspenderet i 1 ml PBS, fjernes en 0,1 ml alikvote pHL-cellesuspension for at holde i 10 mM glucose som en ikke-sultet kontrol.
3. Efter den sidste vask resuspenderes pHL-prøven i PBS suppleret med 1 μg/ml PI.
4. Indsamling af flowcytometridata
   1. Begynd at overvåge glykosomal pH for både de sultede og ikke-sultede prøver ved at måle hver prøve på et flowcytometer hvert 5., 10., 30. eller 90. minut, afhængigt af eksperimentet og prøven. Hent flowcytometridata som beskrevet i trin 4.1 til 4.3, og sørg for, at spændingerne og plottene er forberedt på forhånd.
   2. Kør den ubejdsede WT-kontrol først på 0 min.
   3. Kør den ikke-sultede kontrolprøve på cytometeret hvert 90. minut startende ved 0 min. Til sultetidsforløbsanalysen skal du køre den sultede prøve hvert 10. minut fra 0 minutter. Til glukosetillægsanalysen køres den udsultede prøve ved 0, 5, 10, 20, 30, 60 og 90 minutter; Gentag derefter efter introduktion af glukose.
   4. Inkuber prøverne ved stuetemperatur i løbet af 90 minutters sultetidsforløbet og 180 minutters glukosetillægstidskurset.
5. Analysér .fcs-filerne som beskrevet i trin 5.1 til 5.8.
   BEMÆRK: Supplerende figur S4 viser, hvordan man udfører gating, og hvordan prikplottene skal se ud. Supplerende tabel S3 og supplerende tabel S4 viser resultaterne af henholdsvis glukosesultetidsforløbsanalysen og glukoseadd-back-tidsforløbsassayet.

8. Optimering af analysen til lægemiddelscreening

1. Der vaskes ca. 32 ml pHL-ekspressive BSF-parasitter og 3 ml WT-celler, begge ved ca. 2 × 10⁶ celler/ml, 2x i PBS som beskrevet tidligere.
   BEMÆRK: Mere end 10.000 hændelser skal registreres pr. brønd for at minimere variabiliteten af målte fluorescensforhold og nøjagtigt måle Z-faktorstatistikken. Den mindste kultur, der er nødvendig for at opnå dette, er ca. 26 ml, men vi anbefaler 32 ml for nem håndtering.
   1. Efter den første vask adskilles pHL-prøven ligeligt i to mikrocentrifugeglas.
2. Efter vaskningerne resuspenderes en pHL-prøve i 18 ml PBS indeholdende 5 mM glucose, 0,1% DMSO og TR. Den anden pHL-prøve resuspenderes i 18 ml PBS plus 0,1% DMSO og TR.
   BEMÆRK: DMSO'en bruges til at efterligne buffersammensætningen i en lægemiddelskærm, da forbindelser typisk opløses i DMSO.
3. Overfør disse to celleopløsninger til et reservoir med 12 brønde, 9 ml pr. Brønd.
4. Brug en pipetteringsrobot til at pipettere celleopløsningerne i separate halvdele af en plade med 384 brønde, 80 μL pr. hul.
5. Inkuber pladen ved stuetemperatur i 1,5 timer, omrystes forsigtigt og indpakkes i aluminiumsfolie for at beskytte fluoroforerne mod lys.
6. Kør pladen på et flowcytometer, der er i stand til at køre plader med 384 brønde.
   BEMÆRK: Følgende arbejdsgang er tilpasset en Attune NxT med Cytkick Max Auto Sampler. Hvis der anvendes et andet flowcytometer, skal du fortsætte med at følge de vigtigste trin.
   1. For pladen skal du køre med den hurtigste strømningshastighed (1.000 uL / min) og aktivere boost-tilstand. Anskaf 20 μL/brønd. Inkluder en blandingscyklus og en skyllecyklus mellem hvert hul.
   2. Opret afbildninger som beskrevet i trin 4.1.3.
   3. Kør en ufarvet WT-rørstyring, og optimer spændingerne som beskrevet i trin 4.1.3 og 4.1.4. Kør en udsultet pHL-rørprøve, og optimer VL2- og BL1-spændingerne som beskrevet i trin 4.1.
   4. Begynd at erhverve pladen på flowcytometeret. Pladen føres vandret, så der ikke er nogen væsentlig forskel i anskaffelsestiden mellem de udsultede og ikke-udsultede prøvebrønde. Sørg for, at pladeanskaffelsen er færdig i ~ 1,5 timer.
7. Eksportér .fcs-filerne, og analysér dataene som beskrevet i trin 5.1 til 5.8. Find gennemsnittet (AVG) og standardafvigelsen (SD) af fluorescensforholdene for prøverne behandlet med enten glukose (Glc) eller ingen glukose (sultet).
   BEMÆRK: Data fra vores Z-faktor eksperimenter kan findes i supplerende tabel S5.
8. Statistikken for Z-faktor²⁰ beregnes ved hjælp af ligning (3).
   (3)

Figur 1: Diagram over metoden til scoring af glycosomal pH i levende BSF trypanosomer. (A) Afbildning af cellelinjer, der udtrykker glykosomalt placeret pHluorin2-sensor. Inkluderingen af en peroxisomal målretningssekvens giver kontrol over lokaliseringen. BEMÆRK: Vi forventer, at eliminering af PTS-1 vil føre til cytosolisk lokalisering, hvilket muliggør fremtidig analyse af pH i det subcellulære rum. B) Afbildning af sensorvalideringsassayet. Forkortelse: BSF = blodbaneform. Klik her for at se en større version af denne figur.

BEMÆRK: Z-faktorstatistikken bruges til at bestemme, hvor egnet et assay er for HTS. Værdier mellem 0,5 og 1,0 betyder generelt, at analysekvaliteten er acceptabel for HTS.

pHLuorin2-PTS1 lokalisering til glycosomer i BSF T. brucei
For at vurdere den subcellulære lokalisering af pHluorin2-PTS1 blev parasitter udsat for immunofluorescensassays. Signal fra transgenet colokaliseret med anti-sera hævet mod et glycosom-resident protein, aldolase (TbAldolase) (figur 2A). Den gennemsnitlige Pearsons korrelationskoefficient for colokalisering mellem anti-TbAldolase og pHluorin2-PTS1 var 0,895, hvilket indikerer, at pHluorin2-PTS1 primært var lokaliseret til glycosomer. Med pHluorin2-PTS1 lokaliseret til glykosomet fortsatte vi med at undersøge BF-glycosomets pH.

Figur 2: Lokalisering af pHluorin2-PTS1 til glycosomer i BSF Trypanosoma brucei. (A) Colokalisering af pHluorin2-PTS1 med det glycosomale residente protein TbAldolase. BF 90-13 parasitter blev transfekteret med pLEWpHluorin2-PTS1, og ekspression blev induceret med Doxycyclin (1 μg/ml). TbAldolase blev lokaliseret ved hjælp af anti-TbAldolase sera efterfulgt af inkubation med ged anti-kanin Alexa fluor 568. Den gennemsnitlige Pearsons korrelationskoefficient var 0,895 (30 celler). b) Kalibrering af pHluorin2-PTS1 i BSF T. brucei. Skalastænger = 4 μm. Forkortelse: BSF = blodbaneform. Klik her for at se en større version af denne figur.

kalibrering af pHluorin2-PTS1
Ændringer i pH ændrer excitationsspektret for pHluorin2-PTS1. Under neutral pH er pHluorin2-PTS1-excitation ved 405 nm større end ved 488 nm; når pH falder, er det omvendte sandt ^9,21. For at måle glykosomets relative pH ved flowcytometri målte vi emission, når den blev exciteret af 405 nm-laseren (VL2-kanalen) og emission, når den blev exciteret af 488 nm-laseren (BL1-kanalen) ved hjælp af forholdet VL2 / BL1 (fluorescensforhold) til måling af den relative glycosomale pH. For at konvertere fluorescensforholdet til pH ekvilibrerede vi intracellulær og glycosomal pH med ekstracellulær pH ved hjælp af ionoforerne valinomycin og nigericin^17,18 efterfulgt af flowcytometrianalyse for at finde fluorescensforholdet. Som forventet steg fluorescensforholdet, da ekstracellulær pH steg med en intracellulær K_d på pH 6,5 (figur 2B). Denne K_d var lidt lavere end den rapporterede in vitro K_d for pHluorin2⁹. Interessant nok var BSF glycosomal pH i nærvær af glucose ~ pH 8,0, hvilket var mere basisk end PF-glycosomer i nærvær af glucose²². Vi brugte denne kalibreringskurve til at konvertere fluorescensforholdet til pH i efterfølgende eksperimenter.

Glykosomforsuring på grund af glukosesult
Mens T. brucei PF-parasitter forsurer deres glycosomer, når de sultes af glukose²², er det ukendt, hvordan BSF-glycosomer reagerer på glukose. For at undersøge dette vaskede vi BSF-parasitter, der udtrykte pHluorin2-PTS1 i PBS plus 10 mM glukose for at fjerne dyrkningsmediet og resuspenderede derefter cellerne i PBS uden glukose. Sensorresponsen på denne forstyrrelse blev målt straks og derefter hvert 10. minut i 1,5 time ved flowcytometri. Respons blev sammenlignet med celler i PBS plus 10 mM glucose (ikke-sultet).

Som reaktion på sult observerede vi en gradvis mild forsuring over tid, som plateauede med ~ 90 min (figur 3A). Denne ændring i glycosomal pH var statistisk signifikant (p < 0,0001) og gentagelig på tværs af tre separate eksperimenter. Dette tyder på, at BSF-celler syrner deres glykosomer mildt, når de sultes for glukose, svarende til det respons, der observeres i PF-livsstadiet⁹.

Figur 3: Reversibel forsuring af glycosomer af BSF T. brucei , når de fratages glukose. (A) Glykosomal pH i celler dyrket i fravær (sultet, blå) eller tilstedeværelse (ikke-sultet, rød) af glucose. De udsultede celler blev resuspenderet i PBS uden glukose ~ 2 minutter før den første måling på et Attune NxT flowcytometer. Tre biologiske replikater af tidsforløbet blev udført. Usultede parasitter blev inkuberet i PBS plus 10 mM glucose. En uparret tohalet studerendes t-test blev udført og sammenlignede de udsultede og ikke-sultede 90 minutters tidspunkter, ***p = 0,0001. (B) Tidsforløbet for glykosomal pH-ændring sultet (blå) og ikke-udsultet (rød) BSF-parasitter med 10 mM glukose genindført efter 90 min (grøn stiplet linje). Fem biologiske replikater af tidsforløbet blev udført. NS = ikke signifikant (p = 0,25, uparret tosidet elevs t-test). Klik her for at se en større version af denne figur.

Reversibel glykosomal syring som reaktion på glucose
Vi testede derefter, om BSF-glykosomforsuring var reversibel ved at sulte cellerne og derefter genindføre glukose. Parasitter blev inkuberet i fravær af glucose i 90 min. Glukose (10 mM) blev derefter tilsat, og sensorresponsen blev målt ved cytometri i yderligere 90 minutter (figur 3B). Vi observerede, at efter glukose blev genindført, vendte glycosomal pH tilbage til niveauet før sult i ~ 30 minutter. Disse resultater tyder på, at BSF glycosomal pH er dynamisk og regulerbar som reaktion på glukose, svarende til pH-responset observeret i PF-parasitter.

Tilpasning af pHluorin2-analysen til lægemiddelscreening med høj kapacitet
Glykosomer er essentielle organeller for trypanosomet, da de huser vigtige metaboliske veje. Betydningen af glycosomer tyder på, at hæmmere af deres homeostase kunne holde løfte som potentielle terapeutiske ledere. Her har vi tilpasset analysen for glycosomal pH til et high-throughput format, som vil muliggøre tilpasning til lægemiddelskærme for at identificere hæmmere af glycosomal pH. Vi forventer, at forstyrrelse af reguleringen af dette respons kan være skadeligt for parasitten i betragtning af den kendte indvirkning af pH på glykosom-resident proteinfunktion⁷.

For at etablere formatet med høj kapacitet scorede vi analyserobustheden. For at fuldføre dette blev parasitter induceret til at udtrykke pHluorin2-PTS1 belagt i en 384-brønds mikrotiterplade i enten 5 mM glucose (høje kontroller) eller ingen glucose (lave kontroller) og derefter inkuberet i 90 minutter ved stuetemperatur. Pladen blev derefter analyseret ved flowcytometri. Som vist i figur 4 var der lav variabilitet mellem replikate målinger, og de høje og lave kontroller er godt adskilt, funktioner, der resulterede i en acceptabel Z-faktor på 0,645. Assays med værdier > 0,5 betragtes generelt som robuste nok til tilpasning til screeningskampagner med høj kapacitet. I betragtning af succesen her forventer vi, at denne sensor og tilgang vil blive brugt i fremtidige lægemiddelskærme med høj kapacitet.

Figur 4: Assay til vurdering af egnetheden af pHluorin2-PTS1 sensorbærende BSF til fremtidige HTS-kampagner. Cellerne blev inkuberet i 90 minutter med glucose (høj kontrol, rød, 5 mM glucose) eller uden hexose (lav kontrol, blå, ingen yderligere glucose). Den beregnede Z-faktor var 0,645. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur S1: Kloning af pHluorin2-PTS1-genet i den inducerbare T. brucei-ekspressionsvektor pLEW100v5. (A) Begge vektorer blev dobbelt restriktion fordøjet af HindIII og BamHI og derefter renset. pHluorin2-PTS1-genfragmentet blev ligeret til pLEW100v5 under anvendelse af T4 DNA-ligase. B) pLEW100-pHlourin2-PTS1. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: Colokalisering af pHL med TbAldolase BF 90-13 parasitter transfekteret med pLEWpHluorin2-PTS1. Ekspression blev induceret med doxycyclin (1 μg/ml). TbAldolase blev lokaliseret ved hjælp af anti-TbAldolase sera (fortyndet 1:500 i blok), efterfulgt af inkubation med ged anG-kanin Alexa fluor 568. Den gennemsnitlige Pearsons korrelationskoefficient var 0,895 (30 celler). Skalabjælker = 10 μm. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S3: Repræsentative gating- og punktdiagrammer til kalibrering af BSF pHL-sensorcellelinje ved hjælp af pH 8-kalibreringsbufferprøven som eksempel. Prøver blev farvet med levedygtighedsfarvestoffet PI for at vurdere, hvordan pH påvirkede levedygtigheden ved hjælp af YL2-H-kanalen, men levedygtighed blev ikke brugt i gating-skemaet. En bred port på FSC-A vs SSC-A blev brugt til at gate til celler, da både levende og døde celler blev brugt i kalibreringen. Efter gating for celler blev enkeltceller (singlets) gated ved hjælp af FSC-A vs FSC-H. Endelig blev der anvendt en streng gate til hændelser fluorescerende for pHL i BL1-H- og VL2-H-kanalerne. Forkortelser: BSF = blodbaneform; PI = propidiumiodid FSC-A = fremadrettet spredningstopareal; SSC-A = side scatter-peak område; FSC-H = fremadrettet spredningstophøjde. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S4: Repræsentative gating- og prikplotter for glukosesult og add-back-tidsforløbsassays. Den udsultede 0 minutters prøve bruges som eksempel. Levende celler blev lukket på YL2-H-kanalen, siden PI blev brugt. Celler blev lukket ved hjælp af FSC-A vs SSC-A for at udelukke snavs og aggregater. Singlets blev gated ved hjælp af FSC-A vs FSC-H. Kanalerne BL1-H og VL2-H blev brugt til at gate til pHL+ events. En WT-kontrol blev brugt til at udelukke autofluorescerende hændelser ved indstilling af denne port. Forkortelser: PI = propidiumiodid; FSC-A = fremadrettet spredningstopareal; SSC-A = side scatter-peak område. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel S1: Kanal og almindeligt navn, der anvendes til flowcytometri. Kanalnavnet, fællesnavnet og det anvendte laser- og emissionsfilter angives. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel S2: Resultater fra pHL-kalibrering ved anvendelse af nigericin og valinomycin i forskellige pH-buffere. Denne tabel indeholder de eksporterede statistikker fra FlowJo-analysen af .fcs-filerne. Disse værdier blev brugt til at finde fluorescensforholdet (VL2-H/BL1-H) til kalibrering af pHL, som vist i figur 2. Disse pH-kalibreringsresultater blev også brugt til at interpolere pH til glukosesult og add-back tidsforløbseksperimenter (figur 3). Følgende statistikker blev anvendt til kvalitetskontrol: Samlet antal hændelser, pHL+ antal, PI- (%), PI+ (%) og pHL+ (%). Data for hver biologisk replikat er i en separat fane, og fanen mærket "Opsummerede resultater" indeholder fluorescensforholdene for hver pH-behandling og replikation. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel S3: Analyserede data fra BSF pHL glucose sult tidsforløbsanalyse præsenteret i figur 3A. Denne tabel indeholder eksporterede statistikker fra .fcs-filer, der er analyseret i FlowJo-softwaren. Fluorescensforhold blev beregnet ved at tage forholdet mellem median VL2-H og median BL1-H (begge fra pHL+ populationen). Disse forhold blev samlet i fanen mærket "Opsummerede resultater". PI- (%) blev brugt til at bestemme virkningen af glukosesult på levedygtigheden over tid. Samlet antal og pHL+ antal blev brugt til kvalitetskontrol. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel S4: Analyserede data fra BSF pHL-glukose-add-back-tidsforløbsanalysen præsenteret i figur 3B. Denne tabel indeholder eksporterede statistikker fra .fcs-filer, der er analyseret i FlowJo-softwaren. pHL+ Median VL2/BL1-værdierne blev beregnet ud fra pHL+ median VL2-H og BL1-H i Excel. De øvrige statistikker blev anvendt til kvalitetskontrol. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel S5: Resulterende data fra FlowJo-analyse af Z-Factor-forsøgets high-throughput screeningsassay ved hjælp af pHL. Faner mærket "0 mM glukose" (Lav) og "5 mM glukose" (Høj) inkluderer data fra celler behandlet med henholdsvis 0 eller 5 mM glucose. Disse fluorescensforhold er vist i figur 4. På fanen "Pooled Analysis" blev fluorescensforholdene for begge behandlinger kompileret, og middel- og standardafvigelsen for prøven (SD) blev beregnet for hver. Z-faktorstatistikken blev beregnet ved hjælp af ligning 3. Forholdet mellem middelværdien Høj/Lav blev beregnet for at måle middelfordelingen. Klik her for at downloade denne fil.

Miljøopfattelse og responsmekanismer i det afrikanske trypanosom er dårligt forstået. Ændringer i tilgængeligheden af næringsstoffer er kendt for at udløse forskellige reaktioner i parasitten, herunder forsuring af glycosomer. Her har vi beskrevet en metode til at studere glykosomal pH-respons på miljøforstyrrelser i levende celler ved hjælp af en arvelig proteinsensor, pHluorin2 og flowcytometri.

Der er flere kritiske trin i brugen af sensoren. For det første er karakteriseringen af transfekterede parasitter, der udtrykker transgenet, vigtig, da der kan være celle-til-celle-variation i ekspression. Ekspressionsniveauer for nogle transgener kan falde over tid. Selvom det ikke er blevet observeret med de pHluorin2-bærende celler til dato, kan det være nødvendigt at klone kulturen, hvis sensorresponsen bliver meget variabel (f.eks. efter induktion er sensorsignalet ikke robust), da nogle medlemmer af befolkningen kan udtrykke proteinet på højere niveauer end andre. Alternativt har retransformation og selektion vist sig nyttig til generering af nye cellelinjer med højere (omend muligvis forbigående) udtryk. Hvis re-transfektion er påkrævet, anbefaler vi kloning af individuelle linjer, da ekspressionen af transgenet af interesse kan give en subtil vækstulempe, der fører til tab af høje ekspressorer i befolkningen over tid.

Derudover er det vigtigt at overvåge parasitlevedygtigheden - både under analysen og samtidig rutinemæssigt opretholde kulturer. Vi har inkluderet enten PI eller thiazolrød til dette formål under analysen, og disse reportere sikrer, at data kun afspejler respons i levende celler. Sikring af, at cellefordoblingstiden under normal dyrkning er konstant, især før initiering af store assays (f.eks. HTS-assays), begrænser bekymringen for at starte assays med celler, der ikke trives, hvilket kan ændre høje og lave kontrolsignaler negativt og påvirke skærmens samlede robusthed.

Den tilgang, vi har beskrevet her til måling af glykosomal pH, er robust og følsom. Der er dog begrænsninger for tilgangen. For det første kræves adgang til cytometre med passende kapacitet, herunder prøveudtagere, der er i stand til at acceptere mikrotiterplader. Mens ratiometriske data kan indsamles ved fluorescensmikroskopi, begrænser det begrænsede antal prøver, der kan analyseres på den måde, nytten af tilgange såsom skærme (og tidsforløbsbaserede assays).

En anden potentiel begrænsning er, at analyserne involverer et middel af biosikkerhedsmæssig betydning. Det er muligt, at kernefaciliteter, der huser de instrumenter, der er nødvendige for arbejdet, muligvis ikke tillader levende parasitter på deres udstyr. Disse begrænsninger, sammen med de tekniske udfordringer ved at generere og vedligeholde transgene trypanosomer, kan overvindes gennem samarbejde mellem grupper med passende ekspertise inden for parasitbiologi og celleanalyser.

Arbejdet beskrevet her fokuserer på at bruge den glycosomale pH-sensor i afrikanske trypanosomer, men værktøjet kan tilpasses til brug i andre kinetoplastidparasitter. Mens det er uklart, hvilken rolle forsuring af organellen kan have i biologien af Leishmania spp. eller Trypanosoma cruzi, er det muligt, at pHLuorin2-PTS1 kunne udtrykkes som et transgen i cellerne, da parasitspecifikke ekspressionsvektorer er tilgængelige, og at det glycosomale importmaskineri er ens i organismerne ^5,23,24.

En potentiel anvendelse af de sensorbærende celler er identifikation af små molekyler, der ændrer den cellulære kapacitet til at forsure glykosomet. Disse ville sandsynligvis være skadelige for parasitten, da ændret pH har vist sig at være et muligt middel til regulering af hexokinase, et glycosom-resident protein, der er afgørende i det patogene livscyklusstadium af det afrikanske trypanosom⁷. Det her beskrevne assay er blevet tilpasset til at være høj gennemstrømning (figur 4), hvilket tillader forhør af store kemiske samlinger til denne aktivitet.

Sammenfattende giver dette værktøj mulighed for at dissekere mekanismer involveret i dynamiske reaktioner i en parasitspecifik organel. Ved hjælp af sensorlinjerne i kombination med fremadrettet og omvendt genetik er det sandsynligt, at unikke parasitspecifikke veje vil blive identificeret. Desuden giver sensorlinjerne mulighed for identifikation af små molekylehæmmere af responsen, hvilket åbner døren til ny opdagelse af lægemiddelmål.