Прямое наблюдение и автоматизированное измерение ответов устьиц на синегнойную палочку pv. помидор DC3000 в Arabidopsis thaliana
Summary
Здесь мы представляем простой метод прямого наблюдения и автоматизированного измерения устьичных реакций на бактериальную инвазию у Arabidopsis thaliana. В этом методе используется портативное устройство визуализации устьиц вместе с конвейером анализа изображений, предназначенным для изображений листьев, полученных устройством.
Abstract
Устьица – это микроскопические поры, находящиеся в эпидермисе листьев растений. Регуляция устьичной апертуры имеет решающее значение не только для балансировки поглощения углекислого газа для фотосинтеза и транспирационной потери воды, но и для ограничения бактериальной инвазии. В то время как растения закрывают устьица при распознавании микробов, патогенные бактерии, такие как Pseudomonas syringae pv. помидор DC3000 (PTO), снова откройте закрытые устьица, чтобы получить доступ к внутренней части листа. В традиционных анализах для оценки реакции устьиц на бактериальную инвазию эпидермальные оболочки листьев, листовые диски или отделившиеся листья плавают на бактериальной суспензии, а затем устьица наблюдают под микроскопом с последующим ручным измерением устьичного отверстия. Однако эти анализы громоздки и могут не отражать устьичные реакции на естественную бактериальную инвазию в листе, прикрепленном к растению. Недавно было разработано портативное устройство визуализации, которое может наблюдать за устьицами, прищипывая лист, не отрывая его от растения, вместе с конвейером анализа изображений на основе глубокого обучения, предназначенным для автоматического измерения апертуры устьиц по изображениям листьев, полученным устройством. Здесь, основываясь на этих технических достижениях, представлен новый метод оценки устьичных реакций на бактериальную инвазию у Arabidopsis thaliana . Этот метод состоит из трех простых этапов: распылительная инокуляция Pto , имитирующая естественные инфекционные процессы, непосредственное наблюдение устьиц на листе растения, инокулированного Pto, с помощью портативного устройства визуализации и автоматизированное измерение апертуры устьиц с помощью конвейера анализа изображений. Этот метод был успешно использован для демонстрации закрытия и повторного открытия устьиц во время инвазии Pto в условиях, которые близко имитируют естественное взаимодействие растений и бактерий.
Introduction
Устьица представляют собой микроскопические поры, окруженные парой защитных клеток на поверхности листьев и других надземных частей растений. В постоянно меняющихся условиях регулирование устьичного отверстия является центральным для растений, чтобы контролировать поглощение углекислого газа, необходимого для фотосинтеза, за счет потери воды через транспирацию. Таким образом, количественная оценка устьичного отверстия сыграла важную роль в понимании адаптации растений к окружающей среде. Тем не менее, количественная оценка устьичной апертуры по своей сути является трудоемкой и громоздкой, поскольку требует человеческого труда, чтобы обнаружить и измерить устьичные поры на изображении листа, полученном микроскопом. Чтобы обойти эти ограничения, были разработаны различные методы, облегчающие количественную оценку устьичных апертур у Arabidopsis thaliana, модельного растения, широко используемого для изучения биологии устьиц 1,2,3,4,5,6. Например, порометр может быть использован для измерения скорости транспирации в качестве показателя устьичной проводимости. Однако этот метод не дает прямой информации о устьичном числе и апертуре, определяющих устьичную проводимость. В некоторых исследованиях использовались методы конфокальной микроскопии, выделяющие устьичные поры с использованием флуоресцентного актинового маркера, флуоресцентного красителя или автофлуоресценции клеточной стенки 1,2,3,4,5. Несмотря на то, что эти подходы облегчают обнаружение устьиц, затраты как на эксплуатацию установки конфокальной микроскопии, так и на подготовку образцов для микроскопии могут стать препятствием для рутинного применения. В новаторской работе Sai et al. была разработана модель глубокой нейронной сети для автоматического измерения апертуры устьиц по светлопольным микроскопическим изображениям эпидермальных пилингов A. thaliana 6. Тем не менее, это новшество не освобождает исследователей от задачи подготовки эпидермального пилинга для микроскопического наблюдения. Недавно это препятствие было преодолено путем разработки портативного устройства визуализации, которое может наблюдать за устьицами, прищипывая лист A. thaliana, вместе с конвейером анализа изображений на основе глубокого обучения, который автоматически измеряет апертуру устьиц по изображениям листьев, полученным устройством7.
Устьица способствуют формированию у растений врожденного иммунитета против бактериальных патогенов. Ключом к этому иммунному ответу является закрытие устьиц, которое ограничивает проникновение бактерий через микроскопические поры внутрь листа, где бактериальные патогены размножаются и вызывают заболевания8. Смыкание устьиц индуцируется при распознавании микробассоциированных молекулярных паттернов (MAMP), иммуногенных молекул, которые часто являются общими для класса микробов, рецепторами распознавания образов, локализованными на плазматической мембране (PRR)9. 22-аминокислотный эпитоп бактериального флагеллина, известный как flg22, является типичным MAMP, который индуцирует закрытие устьиц путем его распознавания PRR FLS210. В качестве контрмеры бактериальные патогены, такие как Pseudomonas syringae pv. помидор DC3000 (Pto) и Xanthomonas campestris pv. Везикатории развили механизмы вирулентности для повторного открытия устьиц 9,11,12. Эти устьичные реакции на бактериальные патогены были традиционно проанализированы в тестах, в которых либо эпидермальная корка листьев, либо листовые диски, либо отделившиеся листья плавают на бактериальной суспензии, а затем устьица наблюдаются под микроскопом с последующим ручным измерением устьичного отверстия. Однако эти анализы громоздки и могут не отражать устьичные реакции на естественную бактериальную инвазию, которая происходит в листе, прикрепленном к растению.
В данной работе представлен простой метод исследования закрытия и открытия устьиц во время инвазии ВОМ в условиях, максимально приближенных к естественному взаимодействию растений и бактерий. В этом методе используется портативное устройство визуализации для непосредственного наблюдения устьиц A. thaliana на листе, прикрепленном к растению, инокулированному Pto, вместе с конвейером анализа изображений для автоматического измерения апертуры устьиц.
Protocol
Representative Results
Discussion
В предыдущих исследованиях использовали эпидермальные корки, листовые диски или отделившиеся листья для изучения устьичных реакций на бактериальные инвазии 9,11,12. В отличие от этого, метод, предложенный в этом исследовании, использует…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Благодарим всех участников исследовательского проекта «Совместное создание адаптивных признаков растений через сборку растительно-микробного голобионта» за плодотворные дискуссии. Эта работа была поддержана Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (21H05151 и 21H05149 to A.M. и 21H05152 to Y.T.) и Grant-in-Aid for Challenge Exploratory Research (22K19178 to A.M.).
Materials
| Agar | Nakarai tesque | 01028-85 | |
| Airbrush kits | ANEST IWATA | MX2900 | Accessory kits for SPRINT JET |
| Biotron | Nippon Medical & Chemical Instruments | LPH-411S | Plant Growth Chamber with white fluorescent light |
| Glycerol | Wako | 072-00626 | |
| Half tray | Sakata | 72000113 | A set of tray and lid |
| Hyponex | Hyponex | No catalogue number available | Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants |
| Image J | Natinal Institute of Health | Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Used for manual measurement of stomatal aperture |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KCl | Wako | 163-03545 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | For MES-KOH |
| MES | Wako | 343-01621 | For MES-KOH |
| Portable stomatal imaging device | Phytometrics | Order at https://www.phytometrics.jp/ | Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018. |
| Rifampicin | Wako | 185-01003 | Dissolve in DMSO |
| Silwet-L77 | Bio medical science | BMS-SL7755 | silicone surfactant used in spray inoculation |
| SPRINT JET | ANEST IWATA | IS-800 | Airbrush used for spray inoculation |
| SuperMix A | Sakata seed | 72000083 | Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil |
| Tryptone | Nakarai tesque | 35640-95 | |
| Vermiculite G20 | Nittai | No catalogue number available | Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil |
| White fluorescent light | NEC | FHF32EX-N-HX-S | Used for Biotron |
References
- Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11, e0159291 (2016).
- Bourdais, G., et al. The use of quantitative imaging to investigate regulators of membrane trafficking in Arabidopsis stomatal closure. Traffic. 20 (2), 168-180 (2019).
- Higaki, T., Kutsuna, N., Hasezawa, S. CARTA-based semi-automatic detection of stomatal regions on an Arabidopsis cotyledon surface. Plant Morphology. 26 (1), 9-12 (2014).
- Eisele, J. F., Fäßler, F., Bürgel, F., Chaban, C. A. A rapid and simple method for microscopy-based stomata analyses. PLoS One. 11, e0164576 (2016).
- Chitraker, R., Melotto, M. Assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging. Journal of Visualized Experiments. 44, 2185 (2010).
- Sai, N., et al. StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision. New Phytologist. 238 (2), 904-915 (2023).
- Takagi, M., et al. Image-based quantification of Arabidopsis thaliana stomatal aperture from leaf images. Plant and Cell Physiology. pcad018, (2023).
- Melotto, M., Zhang, L., Oblessuc, P. R., He, S. Y. Stomatal defense a decade later. Plant Physiology. 174 (2), 561-571 (2017).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
- Zeng, W., He, S. A prominent role of the flagellin receptor FLAGELLIN-SENSING2 in mediating stomatal response to Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 in Arabidopsis. Plant Physiology. 153 (3), 1188-1198 (2010).
- Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host and Microbe. 11 (6), 587-596 (2012).
- Raffeiner, M., et al. The Xanthomonas type-III effector XopS stabilizes CaWRKY40a to regulate defense responses and stomatal immunity in pepper (Capsicum annuum). The Plant Cell. 34 (5), 1684-1708 (2022).
- Munemasa, S., Hauser, F., Park, J., Waadt, R., Brandt, B., Schroeder, J. I. Mechanisms of abscisic acid-mediated control of stomatal aperture. Current Opinion in Plant Biology. 28, 154-162 (2015).
- Förster, S., et al. Wounding-induced stomatal closure requires jasmonate-mediated activation of GORK K+ channels by a Ca2+ sensor-kinase CBL1-CIPK5 complex. Developmental Cell. 48 (1), 87-99 (2018).
- Cheng, Y. T., Zhang, L., He, S. Y. Plant-microbe interactions facing environmental challenge. Cell Host and Microbe. 26 (2), 183-192 (2019).
