Direkte Beobachtung und automatisierte Messung der stomatalen Reaktionen auf Pseudomonas syringae pv. Tomate DC3000 in Arabidopsis thaliana

Spaltöffnungen sind mikroskopisch kleine Poren, die von einem Paar Schließzellen auf der Oberfläche von Blättern und anderen oberirdischen Pflanzenteilen umgeben sind. In sich ständig verändernden Umgebungen ist die Regulierung der Stomataöffnung für Pflanzen von zentraler Bedeutung, um die für die Photosynthese erforderliche Kohlendioxidaufnahme auf Kosten des Wasserverlusts durch Transpiration zu steuern. Daher war die Quantifizierung der Stomataöffnung entscheidend für das Verständnis der Anpassung an die Pflanzenumwelt. Die Quantifizierung der Stomataöffnung ist jedoch von Natur aus zeitaufwändig und umständlich, da menschliche Arbeit erforderlich ist, um Stomataporen in einem Blattbild zu erkennen und zu messen, das mit einem Mikroskop aufgenommen wurde. Um diese Einschränkungen zu umgehen, wurden verschiedene Methoden entwickelt, um die Quantifizierung der Stomataöffnung in Arabidopsis thaliana zu erleichtern, einer Modellpflanze, die häufig zur Untersuchung der Stomatabiologie verwendet wird ^1,2,3,4,5,6. Beispielsweise kann ein Porometer verwendet werden, um die Transpirationsrate als Metrik für die stomatäre Leitfähigkeit zu messen. Diese Methode liefert jedoch keine direkten Informationen über die Stomatazahl und die Öffnung, die den stomatären Leitwert bestimmen. In einigen Studien wurden konfokale Mikroskopietechniken verwendet, bei denen Stomataporen mit einem fluoreszierenden Aktinmarker, einem Fluoreszenzfarbstoff oder einer Zellwandautofluoreszenz ^{hervorgehoben wurden} 1,2,3,4,5. Während diese Ansätze den Nachweis von Spaltöffnungen erleichtern, können die Kosten sowohl für den Betrieb einer konfokalen Mikroskopieanlage als auch für die Vorbereitung von Mikroskopieproben ein Hindernis für die Routineanwendung darstellen. In einer bahnbrechenden Arbeit von Sai et al. wurde ein tiefes neuronales Netzwerkmodell entwickelt, um die stomatale Öffnung aus hellfeldmikroskopischen Bildern von A. thaliana-Epidermisschalen automatisch zu messen⁶. Diese Innovation entbindet die Forscher jedoch nicht von der Aufgabe, ein epidermales Peeling für die mikroskopische Beobachtung vorzubereiten. Kürzlich wurde dieses Hindernis durch die Entwicklung eines tragbaren Bildgebungsgeräts überwunden, das Stomata durch Einklemmen eines Blattes von A. thaliana beobachten kann, zusammen mit einer Deep-Learning-basierten Bildanalyse-Pipeline, die automatisch die Stomataöffnung aus Blattbildern misst, die mit dem Gerät aufgenommen wurden⁷.

Spaltöffnungen tragen zur angeborenen Immunität der Pflanze gegen bakterielle Krankheitserreger bei. Der Schlüssel zu dieser Immunantwort ist der Stomataverschluss, der den Eintritt von Bakterien durch die mikroskopisch kleine Pore in das Blattinnere einschränkt, wo sich bakterielle Krankheitserreger vermehren und Krankheiten verursachen⁸. Der Stomataverschluss wird bei der Erkennung von mikrobenassoziierten molekularen Mustern (MAMPs), immunogenen Molekülen, die häufig einer Klasse von Mikroben gemeinsam sind, durch Plasmamembran-lokalisierte Mustererkennungsrezeptoren (PRRs⁾ induziert9. Ein 22-Aminosäuren-Epitop des bakteriellen Flagellins, bekannt als flg22, ist ein typisches MAMP, das durch seine Erkennung durch das PRR FLS2¹⁰ einen Stomataverschluss induziert. Als Gegenmaßnahme können bakterielle Krankheitserreger wie Pseudomonas syringae pv. Tomate DC3000 (Zapfwelle) und Xanthomonas campestris pv. Vesitorien haben Virulenzmechanismen entwickelt, um Stomata wieder zu öffnen ^9,11,12. Diese stomatalen Reaktionen auf bakterielle Krankheitserreger wurden konventionell in Assays analysiert, bei denen entweder epidermale Blattschalen, Blattscheiben oder abgelöste Blätter auf der Bakteriensuspension schwimmen und dann die Spaltöffnungen unter einem Mikroskop beobachtet werden, gefolgt von einer manuellen Messung der Stomataöffnung. Diese Assays sind jedoch umständlich und spiegeln möglicherweise nicht die stomatalen Reaktionen auf die natürliche bakterielle Invasion wider, die in einem an der Pflanze befestigten Blatt auftreten.

Hier wird eine einfache Methode vorgestellt, um den Verschluss und die Wiedereröffnung von Stomata während der Zapfwelleninvasion unter Bedingungen zu untersuchen, die die natürliche Pflanzen-Bakterien-Interaktion genau nachahmen. Diese Methode nutzt das tragbare Bildgebungsgerät für die direkte Beobachtung von A. thaliana-Stomata auf einem Blatt, das an der mit Pto inokulierten Pflanze befestigt ist, zusammen mit der Bildanalyse-Pipeline zur automatisierten Messung der Stomata-Öffnung.