用于测量组蛋白乙酰转移酶 1 乙酰化的乙酰基点击化学测定法
Summary
快速准确的化学检测以筛选特定抑制剂是药物开发武器库中的重要工具。在这里，我们提出了一种可扩展的乙酰点击化学测定法来测量HAT1乙酰化活性的抑制。
Abstract
HAT1，也称为组蛋白乙酰转移酶 1，通过在核小体组装前稳定和乙酰化新生 H4，在染色质合成中起着至关重要的作用。它是各种系统中肿瘤生长所必需的，使其成为癌症治疗的潜在靶点。为了便于鉴定可抑制HAT1酶活性的化合物，我们设计了一种用于快速筛选的乙酰点击测定法。在这个简单的测定中，我们采用重组HAT1 / Rbap46，它是从活化的人细胞中纯化的。该方法以点击化学方法利用乙酰辅酶A类似物4-戊酰辅酶A（4P）。这涉及通过 HAT1 依赖性酰化反应将炔烃手柄酶促转移到生物素化的 H4 N 末端肽上。然后将捕获的肽固定在中性亲和素平板上，然后用生物素叠氮化物进行点击化学官能团化。随后，采用链霉亲和素-过氧化物酶募集来氧化 amplex 红，从而产生定量荧光输出。通过在酰化反应过程中引入化学抑制剂，我们可以根据荧光信号的还原来量化酶抑制。重要的是，该反应具有可扩展性，可以高通量筛选HAT1酶活性的潜在抑制剂。
Introduction
在众多真核乙酰转移酶中，HAT1 是最初分离的组蛋白乙酰转移酶 1,2,3。随后的研究已经牢固地确立了它在染色质复制中的关键作用，特别是在 S 期4 期间合成新核小体中。我们的研究努力使人们认识到 HAT1 在乳腺细胞中受到表皮生长因子 （EGF） 处理的高度刺激5。此外，已经发现 HAT1 是体内快速细胞增殖和肿瘤形成所必需的 6,7,8,9。数据表明，HAT1在协调细胞分裂的合成代谢和表观遗传过程，推动肿瘤生长方面至关重要。
HAT1 与伴侣蛋白 Rbap46 复合物将赖氨酸 5 和 12 上组蛋白 H4 的氨基末端尾部二乙酰化，后者结合组蛋白并将氨基末端呈递给 HAT1。然后将组蛋白四聚体或二聚体10与HAT1 / Rbap46和其他组蛋白伴侣11一起导入细胞核。然后组蛋白被释放以沉积在复制叉或其他位点以支持基因激活或抑制。HAT1 二乙酰化标记对组蛋白 H4 的功能尚不完全清楚。在将H4插入染色质后，它可能在15-30分钟内通过组蛋白脱乙酰酶12,13,14,15的作用迅速去除。因此，HAT1 二乙酰化标记不会在染色质中传播，并且可能不具有真正的表观遗传作用，尽管已经假设在染色质修饰酶向新生染色质募集中发挥作用12。此外，HAT1 不直接乙酰化染色质;其活性仅限于可溶性组蛋白。
小分子组蛋白乙酰转移酶抑制剂的开发受到非特异性和低通量测定的阻碍，通常会导致生物反应性化合物的产生16,17。测量乙酰转移酶活性的金标准测定需要使用 3H-乙酰辅酶 A，这限制了通量并需要辐射。尽管如此，最近，通过使用 3H-乙酰辅酶 A 描述并证实了靶向 CBP/p30018 和 KAT6A/B 19,20 的特异性和高效小分子乙酰转移酶抑制剂。展望未来，正在设计改进的检测方法，以实现更好的通量并避免实验室危害。
乙酰化监测21 的最新进展已使用点击化学来实现酶促反应监测。有多种支持点击的前体，可以通过简单的合成途径获得，也可以购买可以掺入酶反应中。这些反应通常在重组系统中进行，尽管基于细胞的测定也是可行的22。支持点击的辅助因子和底物的优点是，筛选可以直接测量酶活性，而无需偶联读出系统，而耦合读出系统通常会受到筛选化合物的干扰，并且需要额外的处理步骤。这允许仅在酶促步骤中进行抑制剂处理，而所有下游功能化和检测步骤均在大量洗涤后进行，以去除化合物，从而限制了发生检测干扰的可能性。这些优点使得支持点击的检测设计比通常依赖于游离辅酶 A 检测的偶联检测更可取。
一个重要的考虑因素是接受启用点击的辅助因子进入酶活性位点。现有的启用点击的辅助因子可能与针对原生辅因子优化的活动站点不完全兼容。结构信息和建模可用于设计氨基酸取代，以扩大活性位点以掺入改变的底物23。这可以通过改进的酶动力学和更低的底物和酶水平进行筛选。这种方法的缺点是改变的催化口袋可能无法识别与天然酶强烈相互作用的抑制剂。最终，需要结合多种方法来识别和验证潜在的酶抑制剂。
在这里，我们描述了一种使用点击辅因子 4-戊酰辅酶A 24 纯化和测定 HAT1 酶活性的方法。该测定（图1）使用天然酶序列与其所需的伴侣蛋白Rbap46复合物，Rbap46已被证明可以提高酶活性。从人体细胞中纯化酶允许 纤维素中的酶活化，这可以保留对完全酶活性很重要的刺激性翻译后修饰。用于高通量化学筛选的重组酶检测的设计和优化已成功用于鉴定和表征 HAT1 小分子抑制剂。
Protocol
Representative Results
Discussion
在过去的十年中，点击化学变得突出20，使相互作用的化学结构的精确设计成为可能。在此背景下，各种生物正交共价连接21 已成为在其自然环境中形成复合物的有希望的选择。点击化学采用表现出快速和选择性反应的官能团对，通常称为“点击反应”。这些反应在环保、温和的水性条件下有效发生。在这里，我们介绍了一种旨在鉴定和表征 HAT1 乙酰转移酶活?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢 George Zheng 提供 H4K12CoA。我们感谢格鲁伯实验室的成员进行有益的讨论和反馈。我们感谢 NIH/NCI （1K08CA245024）、CPRIT （RR200090） 和 V 基金会 （V2022-022） 的支持。
Materials
| 4P CoA | Cayman Chemical | 10547 | Click chemistry co-factor |
| Amplex Red | Fisher Sci | A12222 | Fluorescence substrate |
| Biotin-PEG-Azide | Alfa Aesar | J64996MC | Click chemistry |
| Copper Sulfate | Sigma-aldrich | 7758-98-7 | Click chemistry |
| DMSO | Fisher Scientific | 67-68-5 | diluent |
| DTT | Acros Organics | 03-12-3483 | reducting agent |
| Forskolin | VWR | 102987-310 | Protein expression |
| Freestyle 293 Expression Medium | Thermo Fisher | 12338018 | Media |
| Freestyle 293-F cells | Thermo Fisher | R790-07 | Protein expression |
| H4-peptide/1-23-GGK-biotin | Anaspec | AS65097 | peptide substrate |
| HEPES | Sigma-aldrich | 7365-45-9 | EB buffer |
| Hydrogen peroxide 30% solution | Sigma-aldrich | Z00183-99-0 | initiator |
| M2 FLAG antibody slurry | Millipore-Sigma | A2220 | Protein purification |
| Macrosep 10K Filter (Pall Lab) | VWR | 89131-980 | Protein purification |
| Neutravidin Plate | Thermo Sci | 15127 | BSA-pre-blocked |
| NP40 (IGEPAL) | MP Biomedical | 198596 | 20x buffer |
| pHEK-293 plasmid | Takara Bio | 3390 | Protein expression |
| Phosphate Buffered Saline 10x | Alfa Aesar | Z00082-33-6 | wash buffer |
| Pra peptide | Genscript | Custom synthesis | biotinylated |
| Sodium Ascorbate | Sigma-aldrich | 134-03-2 | Click chemistry |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich | 7647-14-5 | EB buffer |
| Sodium phosphate | VWR International | 7558-80-7 | buffer |
| Streptavidin | EMD Millipore | 189730 | competitor |
| Streptavidin-HRP | Cell Signaling | 3999S | enzyme |
| THPTA ligand | Fisher Sci | 1010-500 | Click chemistry |
| Tris base | Sigma-aldrich | 77-86-1 | 20x buffer |
| Triton-X 100 | VWR International | 9002-93-1 | EB buffer |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | 9005-64-5 | Wash buffer |
| Urea | Sigma-Aldrich | 57-13-6 | quencher |
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