Enteroider håller på att växa fram som en ny modell för att studera vävnadsfysiologi och patofysiologi, läkemedelsutveckling och regenerativ medicin. Här beskriver vi ett bovint primärt cellodlingssystem med 2D-enteroid-härledda celler som möjliggör samodling med relevanta vävnadscelltyper. Denna modell erbjuder en translationell fördel för modellering av gastrointestinal forskning.
Organoida cellodlingssystem kan rekapitulera den komplexitet som observerats i vävnader, vilket gör dem användbara för att studera värd-patogeninteraktioner, utvärdera läkemedelseffektivitet och toxicitet och vävnadsbioteknik. Tillämpningen av dessa modeller av de beskrivna skälen kan dock vara begränsad på grund av modellernas tredimensionella (3D) karaktär. Till exempel är det utmanande att använda 3D-enteroidodlingssystem för att studera matsmältningssjukdomar på grund av otillgängligheten av tarmlumen och dess utsöndrade ämnen. Faktum är att stimulering av 3D-organoider med patogener kräver antingen luminal mikroinjektion, mekanisk störning av 3D-strukturen eller generering av apikala enteroider. Dessutom kan dessa organoider inte samodlas med immun- och stromaceller, vilket begränsar djupgående mekanistisk analys av patofysiologisk dynamik. För att kringgå detta optimerade vi ett tvådimensionellt (2D) enteroid-härlett monolagerodlingssystem för nötkreatur i primärcellen, vilket möjliggjorde samodling med andra relevanta celltyper. Ileala kryptor isolerade från friska vuxna nötkreatur odlades för att generera 3D-organoider som kryokonserverades för framtida bruk. Ett 2D-monolager skapades med hjälp av återupplivade 3D-enteroider som passerade och stördes för att ge enstaka celler, som såddes på basalmembranextraktbelagda transwell-cellodlingsinsatser, och därigenom exponerade deras apikala yta. Tarmens monolagerpolaritet, cellulära differentiering och barriärfunktion karakteriserades med hjälp av immunofluorescensmikroskopi och mätning av transepitelial elektrisk resistans. Stimulering av monolagrets apikala yta avslöjade monolagrets förväntade funktionalitet, vilket demonstrerades genom cytokinsekretion från både apikala och basala kompartment. Den beskrivna 2D-enteroid-härledda monolagermodellen är mycket lovande när det gäller att undersöka värd-patogeninteraktioner och tarmfysiologi, läkemedelsutveckling och regenerativ medicin.
Djurmodeller i forskning spelar en avgörande roll för att öka vår förståelse av sjukdomars patofysiologi och dynamiken i värdens immunsvar under infektion och stöder utvecklingen av nya förebyggande och terapeutiska strategier 1,2,3,4. Dessa modeller stöder forskning, upptäckt och framsteg på djur och är nyckeln till framsteg inom forskning om människors hälsa. I årtionden har gnagarmodeller legat till grund för framsteg inom immunmekanismer och grundläggande biologisk forskning för mänskliga sjukdomar 3,5,6,7. Medan gnagarmodeller är avgörande vid screening och tidig utvecklingsforskning, erbjuder stordjursmodeller en mer relevant jämförelse vid forskning om mänskliga sjukdomar i både tidiga upptäckts- och senare utvecklingsstudier, inklusive terapeutisk effektivitet och säkerhetstestning 1,3,4,5. Boskap erbjuder tydliga fördelar jämfört med gnagarmodeller för effektivare översättning för humana tillämpningar för vissa sjukdomar, inklusive kryptosporidios, salmonellos, tuberkulos, respiratoriskt syncytialvirus och brucellos 1,7,8. Faktum är att dessa och andra sjukdomar utvecklas spontant hos nötkreatur, som delar flera liknande sjukdomspatogenes och immunprocesser som människor, och som en utavlad population efterliknar nötkreatur den genetiska och miljömässiga heterogenitet som påverkar människans immunsvar 5,8,9,10 . Nyttan av nötkreatursmodeller för forskning om infektionssjukdomar kan maximeras genom att först använda ett sofistikerat odlingssystem och sedan genomföra in vivo-studier stegvis. Den initiala användningen av ett mycket komplext odlingssystem från nötkreatur kan avsevärt minska antalet studier på levande djur och samtidigt förbättra chanserna för framgångsrik translationell och tillämpad forskning. Odlingsmodeller bör rekapitulera sjukdomsprocesserna på organnivå för optimal prediktiv validitet, med bibehållen naturlig vävnadsmikromiljö rumsligt och funktionellt.
Slemhinnans immunsvar är ett mångfacetterat system som består av en mycket effektiv barriär som bildas av gastrointestinala enterocyter och olika populationer av immunceller som ligger under slemhinnans yta11. Detta mycket komplexa system är avgörande under infektion för att upprätthålla GI-homeostas och initiera immunförsvar mot enteriska patogener11. Kommunikation mellan enterocyter och underliggande medfödda immunceller initierar utvecklingen av skyddande immunsvar mot patogena mikroorganismer. Som sådana är odlingssystem som är jämförande i sin komplexitetsnivå nödvändiga för en optimal undersökning av värd-enteriska patogeninteraktioner och är mycket effektiva för att förstå enterisk fysiologi och läkemedelsupptäckt och utveckling12,13. Organoider är ett robust odlingssystem som liknar arkitekturen och funktionen hos ursprungsvävnaden14,15. Flercelligheten hos dessa modeller gör det möjligt att undersöka rollen hos olika cellpopulationer och de cellulära interaktioner som är involverade i enterisk hälsa och sjukdom12,14. Organoidmodeller som härrör från människor i forskning begränsas dock för närvarande av svårigheten att erhålla en tillräcklig kvantitet och jämn kvalitet på humana tarmepitelceller och begränsad cellviabilitet i odling. Odödliga cellinjer kan användas för att konsekvent erhålla höga utbyten av homologa kulturer i dessa modeller; Transformerade celler saknar dock i sig mångfalden och den funktionella komplexiteten hos icke-transformerade epitelceller16,17. Fördelarna med att använda kulturer som härrör från nötkreatursvävnad som en modell för att undersöka gastrointestinala sjukdomar och fysiologi inkluderar den lätthet med vilken vävnadsprover konsekvent kan erhållas från friska donatorer, förbättrad cellviabilitet och större cellulär mångfald som endast kan uppnås med icke-odödlig vävnad. Jämförande vävnadstranskriptomik och karakterisering av tarmorganoider avslöjar likheter i bevarade ortologa gener och cellulära potentialer mellan människor och nötkreatur18. Därför kan ett odlingssystem som härrör från nötkreatur vara fördelaktigt vid undersökning av tarmsjukdomar hos människor, med fynd som lätt kan överföras till humanmedicin.
Protokollet som beskrivs här beskriver en effektiv plattform för att utvärdera värdsvar på enteriska patogener eller föreningar och tarmfysiologi med hjälp av ett bovint enteroid-härlett 2D-primärt cellodlingssystem. Till skillnad från 3D-organoider tillåter 2D-odlingssystem som genereras på transwell-insatser en dubbel odling av tarmceller med immun- eller stromaceller, vilket möjliggör studier av dynamiken på vävnadsnivå. Med tillämpningar inom biomedicinsk forskning, läkemedelsutveckling och effektivitetstestning kan denna fysiologiskt relevanta modell gynna hälsan och utvecklingen av både nötkreatur och människor.
Protokollet som presenteras här beskriver en fysiologiskt relevant modell för att undersöka tarmfysiologi och enteriska sjukdomar. Flera forskargrupper har beskrivit uppkomsten av enteroidkulturer hos nötkreatur, bland annat 2D-monolager 16,19,20,21,22,23,24. Även om generering av flera lager inte är uppenbart tekniskt utmanande, är flera minuters steg avgörande för att utveckla framgångsrika kulturer konsekvent. Som sådan kan reproducerbarheten av 2D-monolager med hjälp av de kortfattat beskrivna metoderna i den publicerade litteraturen vara utmanande för en forskare som är nybörjare inom området organoider att genomföra. Protokollet som beskrivs här är anpassat från dessa protokoll och de som publicerats i andra arter, vilket ger en steg-för-steg-guide för generering av monolager på transwell-insatser som är mycket reproducerbar.
Protokollet som beskrivs här kan enkelt modifieras för att passa de specifika målen för den experimentella designen eller tillgången på reagenser. Enligt detta protokoll kan framgångsrika odlingar uppnås genom sådd av monolager med lägre celltäthet (t.ex. 2,5 x 104) eller i frånvaro av FBS, vilket beskrivs i andra publikationer24. Att ändra dessa parametrar kan dock kräva en ökad kultur för att upprätta ett sammanflytande monolager. Om andra faktorer som är integrerade i studiedesignen, inklusive samodling med immunceller, dikterar ett specifikt tidsförlopp för experimentet, kan såddtätheten ändras efter behov. Medan andra basalmembranformuleringar kan ersättas i stället för den som används i detta protokoll för att generera 3D-enteroider och 2D-monolager, kommer dessa att kräva viss optimering för att bestämma det optimala förhållandet mellan basalmembran och media.
Tillämpningen av transwell-insatser i den beskrivna metodiken har många fördelar jämfört med enskiktstillväxt på konventionella plast- och 3D-enteroidkulturer. Jämfört med vanliga vävnadsodlingsplattor främjar användning av transbrunnar för monolagerkulturer cellulär differentiering och organisation på ett sätt som behåller likheten med tarmkryptor14,25. Tarmepitelbarriären är avgörande för att förhindra translokation av gifter och mikroorganismer i kroppen samtidigt som den underlättar näringsupptaget. Som sådan är det viktigt att förstå hur tarmens barriärintegritet fungerar hos friska och förändras under tarmstörningar eller som svar på föreningar. Till skillnad från 3D-enteroidkulturer är objektiv bedömning av tarmbarriärens integritet möjlig när man kombinerar monolager på transbrunnar och mäter TEER, vilket visas här i14,25. Generering av 2D-monolager på transbrunnar möjliggör också dubbelodling med relevanta celltyper som immun- eller stromaceller. Detta gör det möjligt att karakterisera kritiskt viktig överhörning mellan tarmceller och celler i vävnadens mikromiljö, vilket inte kan uppnås med 3D-kulturer. Exponering av monoskiktets apikala yta möjliggör inte bara experimentell exponering för patogener och föreningar och insamling av luminalprodukter, utan möjliggör också studier av andra aspekter av tarmfysiologi och sjukdomar, inklusive undersökning av tarmmikrobiota och molekylär absorptions- eller transportfysiologi13. Oberoende kontroll över de apikala och basala tarmytorna är en klar fördel jämfört med 3D-enteroidmodeller.
Genom flera försöksexperiment identifierade vi viktiga steg som bidrog till protokollets framgång. Medan vävnadsprover från hela tarmen kan kylas över natten och behandlas följande dag, måste vävnadsdissociationen och isoleringen av kryptfragmentstegen utföras omedelbart för att förhindra sönderfall av de isolerade kryptfraktionerna. Efter att ha slutfört PBS-tvättarna kan centrifugering av kryptorna i tvättmedia hjälpa till att förhindra krypthaveri, som beskrivs i steg 2.3.10. När du passerar enteroiderna eller skördar dem för monolagerbildning är det viktigt att separera enteroiderna från BME-kupolerna. Tvättmediet måste vara iskallt för att hjälpa till att lösa upp BME. Däremot kan användning av förvärmd trypLE och filtrering av cellsuspensionen två gånger hjälpa till att bilda de enskilda celler som behövs för monolagergenerering. Slutligen kan manuell manövrering av plattan i form av siffran 8 hjälpa till att jämnt fördela de enskilda cellerna över transbrunnsinsatsen.
En viktig begränsning i detta protokoll är att 2D-monolagren producerades från enteroidstammar som genererats från en mogen Holstein-stut (>2 år gammal). Den mognande mag-tarmkanalen hos kalvar kan kräva mindre modifieringar av det beskrivna protokollet för att ge optimala resultat. Rasspecifika skillnader i tarmfysiologin hos nötkreatursraser har beskrivits i litteraturen26. Även om det är okänt om dessa skillnader kan påverka enteroid och efterföljande generering av monolager, misstänker vi att eventuella skillnader endast skulle resultera i mindre ändringar i vårt protokoll. Dessutom har 2D-kulturmodellen vissa inneboende nackdelar. Jämfört med 3D-enteroidmodeller kan 2D-kulturer sakna vissa aspekter av tarmvävnadsarkitekturen och cellulär mångfald och skapa begränsningar och utmaningar i samband med förökningen av 2D-kultur13. Ändå visar studier att vissa monolager kan efterlikna förväntad kryptoorganisation27, och vissa av dessa begränsningar kan till och med övervinnas genom att etablera 2D-kulturer med ett luft-vätskegränssnitt. Icke desto mindre bör begränsningarna i denna modell beaktas fullt ut för att avgöra om dess tillämpning är lämplig för den experimentella fråga som ställs.
Detta protokoll beskriver ett optimerat odlingssystem som modellerar den bovina mag-tarmkanalen med hjälp av enteroider som härrör från bovint ileum för att bilda monolager på transwell-insatser. Med ett brett spektrum av tillämpningar, från forskning om infektionssjukdomar till läkemedelsupptäckt och regenerativ medicin, kan detta odlingssystem med hög kapacitet leda till en aldrig tidigare skådad utveckling av förebyggande och terapeutiska strategier som kan vara ömsesidigt fördelaktiga för djurs och människors hälsa.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner användningen av Cellular and Molecular Core Facility vid Midwestern University.
0.2 mL pipette tip | MidSci | PR-200RK-S | |
1 µm PET 24-well cell culture inserts | Corning | 353104 | |
1000 mL pipette tip | MidSci | PR-1250RK-S | |
22 G needle | Becton, Dickinson and Company | 305156 | |
24-well culture vessel | Corning | 353504 | |
40 μm cell strainer | Corning | 431750 | |
50 mL centrifuge tube | Fisher scientific | 14-955-240 | |
5-mL pipet tip | Fisher scientific | 30075307 | |
5 mL syringe | Becton, Dickinson and Company | 309647 | |
5 mL tube | Eppendorf | 30119401 | |
Anti-Cytokeratin -18 (C-04) | Abcam | AB668-1001 | |
B-27 supplement without vitamin A | Gibco | 12-587-010 | |
Belysa software | Luminex | 40-122 | Immunoassay curve fitting software |
Bovine serum albumin (BSA) | Fisher bioreagents | BP9704-100 | |
Caspofungin acetate | Selleckchem | S3073 | |
Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
Chromogranin-A (E-5) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271738 | |
Coverslips | Fisher scientific | 12-540-C | |
Cryovials | Neptune scientific | 3471.X | |
Cultrex Ultimatrix RGF BME | R&D Systems | BME001-05 | |
DAPI | MilliporeSigma | D9542-5MG | |
Dissecting scissors | VWR | 82027-588 | |
Dithiothreitol (DTT) solution | Thermo Scientific | FERR0861 | |
DMEM/ F-12 1.1 medium (with L-glutamine, without HEPES) | Cytiva | SH30271.01 | |
E-cadherin | Cell Signaling Technology | #3195 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher Scientific | BP2482500 | |
FBS | Corning | MT35070CV | |
Gentamicin | Gibco | 15710064 | |
Glass microscope slide | Fisher scientific | 12-550-07 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
Hemacytometer | Bio-Rad | 1450015 | |
IntestiCult organoid Differentiation medium (Human) | StemCell Technologies | 100-0214 | |
IntestiCult organoid growth medium (Human) | StemCell Technologies | 0-6010 | |
Keyence BZ-X700 | Keyence | BZ-X700 | |
LY2157299 (Galunisertib) | Selleckchem | S2230 | |
MAGPIX system | Luminex | Magpix system | Compact multiplexing unit |
Microscope | Keyence | BZ-X700 | |
MILLIPLEX Bovine Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel | MilliporeSigma | BCYT1-33K | Bead-based multiplex assay |
Mr. Frosty container | Nalgene | 5100-0001 | |
Non-Enzymatic Cell Dissociation Solution | ATCC | 30-2103 | |
NutriFreeze D10 Cryopreservation Media | Biological Industries | 05-713-1B | |
Orbital shaking platform | Thermo Fisher | 88880021 | |
Pam3Csk4 | invivogen | tlrl-pms | |
Parafilm sealing film | dot scientific inc. | #HS234526C | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Phalloidin-FITC | R&D Systems | 5782/12U | |
Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-20 | |
Prolong Glass Antifade | Invitrogen | P36982 | |
Rabbit anti-human Lyzozyme (EC3.2.1.17) | Agilent technologies | A009902-2 | |
SB202190 (FHPI) | Selleckchem | S1077 | |
Shaking water bath | Thermo Fisher | MaxQ 7000 | |
Sodium Azide | VWR | BDH7465-2 | |
Streptomycin | Teknova | S6525 | |
Trypan Blue dye | Gibco | 15250-061 | |
TrypLE express enzyme | Life technologies | 12604013 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | |
Voltohmmeter | MilliporeSigma | Millicell ERS-2 | |
Y-27632 | Selleckchem | S1049 |