توليد نظام استزراع أحادي الطبقة ثنائي الأبعاد مشتق من الإنتيرويد البقري للتطبيقات في البحوث الطبية الحيوية الانتقالية
Summary
تظهر Enteroids كنموذج جديد لدراسة فسيولوجيا الأنسجة والفيزيولوجيا المرضية ، وتطوير الأدوية ، والطب التجديدي. هنا ، نصف نظام الثقافة المشتقة من الخلايا الأولية 2D المشتقة من الخلايا الأولية التي تسمح بالزراعة المشتركة مع أنواع خلايا الأنسجة ذات الصلة. يقدم هذا النموذج ميزة انتقالية لنمذجة أبحاث الجهاز الهضمي.
Abstract
يمكن لأنظمة زراعة الخلايا العضوية تلخيص التعقيد الذي لوحظ في الأنسجة ، مما يجعلها مفيدة في دراسة التفاعلات بين المضيف والممرض ، وتقييم فعالية الدواء وسميته ، والهندسة الحيوية للأنسجة. ومع ذلك ، قد يكون تطبيق هذه النماذج للأسباب الموضحة محدودا بسبب الطبيعة ثلاثية الأبعاد (3D) لهذه النماذج. على سبيل المثال ، يعد استخدام أنظمة الثقافة المعوية 3D لدراسة أمراض الجهاز الهضمي أمرا صعبا بسبب عدم إمكانية الوصول إلى تجويف الأمعاء ومواده المفرزة. في الواقع ، يتطلب تحفيز المواد العضوية ثلاثية الأبعاد بمسببات الأمراض إما الحقن المجهري اللمعي ، أو الاضطراب الميكانيكي للهيكل ثلاثي الأبعاد ، أو توليد المعوية القمية. علاوة على ذلك ، لا يمكن زراعة هذه الكائنات العضوية مع الخلايا المناعية واللحمية ، مما يحد من التحليل الميكانيكي المتعمق في الديناميات الفيزيولوجية المرضية. للتحايل على هذا ، قمنا بتحسين نظام زراعة أحادي الطبقة مشتق من الخلايا الأولية البقرية ثنائية الأبعاد (2D) ، مما يسمح بالزراعة المشتركة مع أنواع الخلايا الأخرى ذات الصلة. تم استزراع الخبايا اللفائفية المعزولة من الماشية البالغة السليمة لتوليد عضويات 3D تم حفظها بالتبريد للاستخدام في المستقبل. تم إنشاء طبقة أحادية 2D باستخدام المعوية ثلاثية الأبعاد التي تم إحياؤها والتي تم تمريرها وتعطيلها لإنتاج خلايا مفردة ، والتي تم زرعها على إدخالات زراعة خلايا transwell المغلفة بمستخلص الغشاء القاعدي ، وبالتالي فضح سطحها القمي. تم توصيف قطبية الطبقة الأحادية المعوية والتمايز الخلوي ووظيفة الحاجز باستخدام الفحص المجهري المناعي وقياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة. كشف تحفيز السطح القمي للطبقة الأحادية عن الوظيفة المتوقعة للطبقة الأحادية ، كما يتضح من إفراز السيتوكين من كل من المقصورات القمية والقاعدية. يحمل نموذج الطبقة الأحادية المشتقة من 2D المعوي الموصوف وعدا كبيرا في التحقيق في تفاعلات المضيف الممرض وعلم وظائف الأعضاء المعوي ، وتطوير الأدوية ، والطب التجديدي.
Introduction
تلعب النماذج الحيوانية في البحث دورا حاسما في تعزيز فهمنا للفيزيولوجيا المرضية للمرض وديناميكيات الاستجابة المناعية للمضيف أثناء العدوى ودعم تطوير استراتيجيات وقائية وعلاجية جديدة1،2،3،4. تدعم هذه النماذج اكتشاف الأبحاث والتقدم في وهي أساسية لتقدم أبحاث صحة الإنسان. لعقود من الزمان ، دعمت نماذج القوارض التقدم في آليات المناعة وأبحاث البيولوجيا الأساسية للأمراض البشرية3،5،6،7. في حين أن نماذج القوارض مهمة في الفحص وأبحاث التطوير المبكر ، تقدم النماذج الحيوانية الكبيرة مقارنة أكثر صلة في البحث عن الأمراض البشرية في كل من الاكتشاف المبكر ودراسات التطوير اللاحقة ، بما في ذلك الفعالية العلاجية واختبار السلامة1،3،4،5. تقدم الثروة الحيوانية مزايا واضحة مقارنة بنماذج القوارض لترجمة أكثر كفاءة للتطبيقات البشرية لبعض الأمراض ، بما في ذلك داء الكريبتوسبوريديوسيس ، السالمونيلا ، السل ، الفيروس المخلوي التنفسي ، وداء البروسيلات1،7،8. في الواقع ، تتطور هذه الأمراض وغيرها تلقائيا في الماشية ، والتي تشترك في العديد من الأمراض المماثلة والعمليات المناعية للبشر ، وكمجموعة مهجنة ، تحاكي الماشية عدم التجانس الجيني والبيئي الذي يؤثر على الاستجابات المناعية البشرية5،8،9،10. يمكن تعظيم فوائد نماذج الأبقار لأبحاث الأمراض المعدية من خلال استخدام نظام استزراع متطور أولا ثم تنفيذ الدراسات في الجسم الحي تدريجيا. يمكن أن يؤدي الاستخدام الأولي لنظام الاستزراع المشتق من الأبقار شديد التعقيد إلى تقليل عدد الدراسات على الحية بشكل كبير مع تحسين فرص نجاح البحوث الانتقالية والتطبيقية. يجب أن تلخص نماذج الاستزراع عمليات المرض على مستوى الأعضاء من أجل الصلاحية التنبؤية المثلى ، مع الاحتفاظ بالبيئة المكروية للأنسجة الأصلية مكانيا ووظيفيا.
الاستجابة المناعية المخاطية هي نظام متعدد الأوجه يتكون من حاجز عالي الكفاءة يتكون من الخلايا المعوية المعدية المعوية ومجموعات متنوعة من الخلايا المناعية الموجودة تحت سطح الغشاء المخاطي11. هذا النظام المعقد للغاية أمر بالغ الأهمية أثناء العدوى في الحفاظ على توازن الجهاز الهضمي وبدء الدفاعات المناعية ضد مسببات الأمراض المعوية11. التواصل بين الخلايا المعوية والخلايا المناعية الفطرية الكامنة يبدأ تطوير الاستجابات المناعية الوقائية ضد الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض. على هذا النحو ، فإن أنظمة الاستزراع المقارنة في مستوى تعقيدها ضرورية لإجراء تحقيق مثالي في تفاعلات مسببات الأمراض المعوية المضيفة وهي فعالة للغاية في فهم علم وظائف الأعضاء المعوي واكتشاف الأدوية وتطويرها12،13. المواد العضوية هي نظام استزراع قوي يشبه بنية ووظيفة نسيج المنشأ14,15. تسمح تعدد الخلايا لهذه النماذج بالتحقيق في دور مجموعات الخلايا المتنوعة والتفاعلات الخلوية المشاركة في الصحة المعوية والمرض12,14. ومع ذلك ، فإن النماذج العضوية المشتقة من الإنسان في البحث محدودة حاليا بسبب صعوبة الحصول على كمية كافية ونوعية متسقة من الخلايا الظهارية المعوية البشرية ومحدودية صلاحية الخلية في الثقافة. يمكن استخدام خطوط الخلايا الخالدة للحصول على غلات عالية من الثقافات المتماثلة في هذه النماذج باستمرار. ومع ذلك ، تفتقر الخلايا المحولة بطبيعتها إلى التنوع والتعقيد الوظيفي للخلايا الظهارية غير المحولة 16,17. تشمل مزايا استخدام المزارع المشتقة من أنسجة الأبقار كنموذج للتحقيق في أمراض الجهاز الهضمي وعلم وظائف الأعضاء السهولة التي يمكن بها الحصول على عينات الأنسجة باستمرار من المتبرعين الأصحاء ، وتحسين صلاحية الخلايا ، وزيادة التنوع الخلوي الذي لا يمكن تحقيقه إلا مع الأنسجة غير الخالدة. تكشف ترانسكريبتوميات الأنسجة المقارنة وتوصيف الكائنات العضوية المعوية عن أوجه تشابه في الجينات المتعامدة المحفوظة والإمكانات الخلوية بين البشر والماشية18. لذلك ، قد يكون نظام الاستزراع العضوي البقري المشتق مفيدا في التحقيق في الأمراض المعوية البشرية ، مع ترجمة النتائج بسهولة إلى الطب البشري.
يفصل البروتوكول الموصوف هنا منصة فعالة لتقييم استجابات المضيف لمسببات الأمراض المعوية أو المركبات وعلم وظائف الأعضاء المعوية باستخدام نظام زراعة الخلايا الأولية 2D المشتق من الأمعاء البقرية. على عكس المواد العضوية 3D ، تسمح أنظمة الثقافة 2D المتولدة على إدخالات transwell بزراعة مزدوجة للخلايا المعوية ذات الخلايا المناعية أو اللحمية ، مما يسمح بدراسة ديناميكيات مستوى الأنسجة. مع التطبيقات في البحوث الطبية الحيوية ، وتطوير الأدوية ، واختبار الفعالية ، يمكن لهذا النموذج ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية أن يفيد صحة وتقدم كل من الماشية والناس على حد سواء.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف البروتوكول المقدم هنا نموذجا ذا صلة من الناحية الفسيولوجية للتحقيق في فسيولوجيا الأمعاء والاضطرابات المعوية. وصفت العديد من المجموعات البحثية جيل الثقافات المعوية البقرية ، بما في ذلك 2D monolayers16،19،20،21،22،23،24. في حين أن التوليد أحادي الطبقة لا يمثل تحديا تقنيا بشكل علني ، إلا أن الخطوات التي تستغرق عدة دقائق ضرورية في تطوير ثقافات ناجحة باستمرار. على هذا النحو ، فإن استنساخ أحادي الطبقات 2D باستخدام الأساليب الموصوفة بإيجاز في الأدبيات المنشورة يمكن أن يكون تحديا للباحث المبتدئ في مجال المواد العضوية. تم تكييف البروتوكول الموصوف هنا من هذه البروتوكولات وتلك المنشورة في الأنواع الأخرى ، مما يوفر دليلا خطوة بخطوة لتوليد أحادي الطبقة على إدخالات البئر التبادلية القابلة للتكرار بشكل كبير.
يمكن بسهولة تعديل البروتوكول المبين هنا ليناسب الأهداف المحددة للتصميم التجريبي أو توافر الكواشف. في الواقع ، باتباع هذا البروتوكول ، يمكن تحقيق الثقافات الناجحة عن طريق زرع طبقة أحادية بكثافة خلية أقل (على سبيل المثال ، 2.5 × 104) أو في حالة عدم وجود FBS ، كما هو موضح في منشورات أخرى24. ومع ذلك ، قد يتطلب تغيير هذه المعلمات زيادة الثقافة لإنشاء طبقة أحادية متقاربة. على هذا النحو ، إذا كانت هناك عوامل أخرى جزء لا يتجزأ من تصميم الدراسة ، بما في ذلك الثقافة المشتركة مع الخلايا المناعية ، تملي مسارا زمنيا محددا للتجربة ، فيمكن تغيير كثافة البذر حسب الحاجة. في حين يمكن استبدال تركيبات الغشاء القاعدي الأخرى بدلا من تلك المستخدمة في هذا البروتوكول لتوليد 3D enteroids و 2D monolayers ، فإن هذه ستتطلب بعض التحسين لتحديد النسبة المثلى للغشاء القاعدي إلى الوسائط.
تطبيق إدراج transwell في المنهجية الموصوفة له العديد من الفوائد على نمو أحادي الطبقة على الأواني البلاستيكية التقليدية والثقافات المعوية 3D. بالمقارنة مع لوحات زراعة الأنسجة القياسية ، فإن استخدام transwells للثقافات أحادية الطبقة يعزز التمايز الخلوي والتنظيم بطريقة تحتفظ بما يشبه الخبايا المعوية14,25. الحاجز الظهاري المعوي أمر حيوي في منع انتقال السموم والكائنات الحية الدقيقة إلى الجسم مع تسهيل امتصاص العناصر الغذائية في نفس الوقت. على هذا النحو ، من الأهمية بمكان أن نفهم كيف تعمل سلامة حاجز الأمعاء بشكل صحي ويتم تغييرها أثناء الاضطرابات المعوية أو استجابة للمركبات. على عكس الثقافات المعوية ثلاثية الأبعاد ، يمكن إجراء تقييم موضوعي لسلامة الحاجز المعوي عند الجمع بين الطبقات الأحادية على transwells وقياس TEER ، كما هو موضح هنا14،25. توليد 2D أحادي الطبقات على transwells يسمح أيضا ثقافة مزدوجة مع أنواع الخلايا ذات الصلة مثل الخلايا المناعية أو اللحمية. وهذا يسمح بتداخل مهم للغاية بين الخلايا المعوية وخلايا البيئة الدقيقة للأنسجة ، والتي لا يمكن تحقيقها مع ثقافات 3D. إن تعرض السطح القمي للطبقة الأحادية لا يسمح فقط بالتعرض التجريبي لمسببات الأمراض والمركبات وجمع المنتجات اللمعية ولكنه يتيح أيضا إجراء دراسات في جوانب أخرى من فسيولوجيا الأمعاء والأمراض ، بما في ذلك التحقيق في الجراثيم المعوية والامتصاص الجزيئي أو فسيولوجيا النقل13. السيطرة المستقلة على الأسطح المعوية القمية والقاعدية هي ميزة واضحة على نماذج المعوية 3D.
من خلال العديد من التجارب التجريبية، حددنا الخطوات الرئيسية التي ساهمت في نجاح البروتوكول. بينما يمكن تبريد عينات الأنسجة المعوية الكاملة طوال الليل ومعالجتها في اليوم التالي ، يجب إجراء تفكك الأنسجة وعزل خطوات شظية القبو على الفور لمنع تفكك أجزاء القبو المعزولة. بعد الانتهاء من عمليات غسل PBS ، يمكن أن يساعد الطرد المركزي للخبايا في Wash Media في منع انهيار التشفير ، كما هو مفصل في الخطوة 2.3.10. عند تمرير المعوية أو حصادها لتشكيل طبقة واحدة ، من الضروري فصل المعوية عن قباب BME. يجب أن تكون وسائط الغسيل باردة جليدية للمساعدة في إذابة BME. في المقابل ، يمكن أن يساعد استخدام TrypLE المسخن مسبقا وتصفية تعليق الخلية مرتين في تكوين الخلايا المفردة اللازمة لتوليد الطبقة الأحادية. أخيرا ، يمكن أن تساعد المناورة اليدوية للوحة على شكل الرقم 8 في تشتيت الخلايا المفردة بالتساوي فوق ملحق البئر.
أحد القيود المهمة لهذا البروتوكول هو أن الطبقة الأحادية ثنائية الأبعاد تم إنتاجها من مخزون معوي تم إنشاؤه من توجيه هولشتاين ناضج (> 2 سنة من العمر). قد يتطلب الجهاز الهضمي الناضج في العجول تعديلات طفيفة على البروتوكول الموصوف لتحقيق أفضل النتائج. تم وصف الاختلافات الخاصة بالسلالة في فسيولوجيا الأمعاء لسلالات الماشية في الأدبيات26. في حين أنه من غير المعروف ما إذا كانت هذه الاختلافات يمكن أن تؤثر على توليد الطبقة المعوية وأحادية الطبقة اللاحقة ، فإننا نشك في أن أي اختلافات ستؤدي فقط إلى تغييرات طفيفة في بروتوكولنا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن نموذج ثقافة 2D له بعض العيوب المتأصلة. بالمقارنة مع نماذج 3D المعوية ، قد تفتقر الثقافات ثنائية الأبعاد إلى بعض جوانب بنية الأنسجة المعوية والتنوع الخلوي وتخلق قيودا وتحديات مرتبطة بنشر ثقافة 2D13. ومع ذلك ، تظهر الدراسات أن بعض الطبقات الأحادية يمكنها محاكاة تنظيم التشفير المتوقع27 ، ويمكن التغلب على بعض هذه القيود من خلال إنشاء ثقافات ثنائية الأبعاد بواجهة هواء سائلة. ومع ذلك ، ينبغي النظر بشكل كامل في قيود هذا النموذج لتحديد ما إذا كان تطبيقه مناسبا للسؤال التجريبي المطروح.
يصف هذا البروتوكول نظام استزراع محسن يقوم بنمذجة الجهاز الهضمي البقري باستخدام المعوية المشتقة من الدقاق البقري لتشكيل طبقات أحادية على إدخالات البئر. مع مجموعة واسعة من التطبيقات من أبحاث الأمراض المعدية إلى اكتشاف الأدوية والطب التجديدي ، يمكن أن يؤدي نظام الاستزراع عالي الإنتاجية هذا إلى تطوير غير مسبوق للاستراتيجيات الوقائية والعلاجية التي يمكن أن تكون مفيدة للطرفين لصحة والإنسان.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نقر باستخدام المرفق الخلوي والجزيئي الأساسي في جامعة ميدويسترن.
Materials
| 0.2 mL pipette tip | MidSci | PR-200RK-S | |
| 1 µm PET 24-well cell culture inserts | Corning | 353104 | |
| 1000 mL pipette tip | MidSci | PR-1250RK-S | |
| 22 G needle | Becton, Dickinson and Company | 305156 | |
| 24-well culture vessel | Corning | 353504 | |
| 40 μm cell strainer | Corning | 431750 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher scientific | 14-955-240 | |
| 5-mL pipet tip | Fisher scientific | 30075307 | |
| 5 mL syringe | Becton, Dickinson and Company | 309647 | |
| 5 mL tube | Eppendorf | 30119401 | |
| Anti-Cytokeratin -18 (C-04) | Abcam | AB668-1001 | |
| B-27 supplement without vitamin A | Gibco | 12-587-010 | |
| Belysa software | Luminex | 40-122 | Immunoassay curve fitting software |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher bioreagents | BP9704-100 | |
| Caspofungin acetate | Selleckchem | S3073 | |
| Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Chromogranin-A (E-5) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271738 | |
| Coverslips | Fisher scientific | 12-540-C | |
| Cryovials | Neptune scientific | 3471.X | |
| Cultrex Ultimatrix RGF BME | R&D Systems | BME001-05 | |
| DAPI | MilliporeSigma | D9542-5MG | |
| Dissecting scissors | VWR | 82027-588 | |
| Dithiothreitol (DTT) solution | Thermo Scientific | FERR0861 | |
| DMEM/ F-12 1.1 medium (with L-glutamine, without HEPES) | Cytiva | SH30271.01 | |
| E-cadherin | Cell Signaling Technology | #3195 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher Scientific | BP2482500 | |
| FBS | Corning | MT35070CV | |
| Gentamicin | Gibco | 15710064 | |
| Glass microscope slide | Fisher scientific | 12-550-07 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Hemacytometer | Bio-Rad | 1450015 | |
| IntestiCult organoid Differentiation medium (Human) | StemCell Technologies | 100-0214 | |
| IntestiCult organoid growth medium (Human) | StemCell Technologies | 0-6010 | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | BZ-X700 | |
| LY2157299 (Galunisertib) | Selleckchem | S2230 | |
| MAGPIX system | Luminex | Magpix system | Compact multiplexing unit |
| Microscope | Keyence | BZ-X700 | |
| MILLIPLEX Bovine Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel | MilliporeSigma | BCYT1-33K | Bead-based multiplex assay |
| Mr. Frosty container | Nalgene | 5100-0001 | |
| Non-Enzymatic Cell Dissociation Solution | ATCC | 30-2103 | |
| NutriFreeze D10 Cryopreservation Media | Biological Industries | 05-713-1B | |
| Orbital shaking platform | Thermo Fisher | 88880021 | |
| Pam3Csk4 | invivogen | tlrl-pms | |
| Parafilm sealing film | dot scientific inc. | #HS234526C | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phalloidin-FITC | R&D Systems | 5782/12U | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| Prolong Glass Antifade | Invitrogen | P36982 | |
| Rabbit anti-human Lyzozyme (EC3.2.1.17) | Agilent technologies | A009902-2 | |
| SB202190 (FHPI) | Selleckchem | S1077 | |
| Shaking water bath | Thermo Fisher | MaxQ 7000 | |
| Sodium Azide | VWR | BDH7465-2 | |
| Streptomycin | Teknova | S6525 | |
| Trypan Blue dye | Gibco | 15250-061 | |
| TrypLE express enzyme | Life technologies | 12604013 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | |
| Voltohmmeter | MilliporeSigma | Millicell ERS-2 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
- Gerdts, V., et al. Large animal models for vaccine development and testing. ILAR Journal. 56 (1), 53-62 (2015).
- Reza Khorramizadeh, M., Saadat, F. Animal models for human disease. Animal Biotechnology. Chapter 8, 153-171 (2020).
- Meyerholz, D. K., Beck, A. P., Singh, B. Innovative use of animal models to advance scientific research. Cell and Tissue Research. 380 (2), 205-206 (2020).
- Hamernik, D. L. Farm animals are important biomedical models. Animal Frontiers. 9 (3), (2019).
- Ribitsch, I., et al. Large animal models in regenerative medicine and tissue engineering: To do or not to do. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 972 (2020).
- Wagar, L. E., DiFazio, R. M., Davis, M. M. Advanced model systems and tools for basic and translational human immunology. Genome Medicine. 10 (1), 73 (2018).
- Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).
- Roth, J. A., Tuggle, C. K. Livestock models in translational medicine. ILAR Journal. 56 (1), 1-6 (2015).
- Schultz, R. D., Dunne, H. W., Heist, C. E. Ontogeny of the bovine immune response. Infection and Immunity. 7 (6), 981-991 (1973).
- Potter, A. A., et al. Large animal models for vaccine development and testing. ILAR Journal. 56 (1), 53-62 (2015).
- Ahluwalia, B., Magnusson, M. K., Öhman, L. Mucosal immune system of the gastrointestinal tract: maintaining balance between the good and the bad. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 52 (11), 1185-1193 (2017).
- Roodsant, T., et al. A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to Study host-pathogen interaction in the small intestine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).
- Liu, Y., Chen, Y. G. 2D- and 3D-based intestinal stem cell cultures for personalized medicine. Cells. 7 (12), 225 (2018).
- Duque-Correa, M. A., Maizels, R. M., Grencis, R. K., Berriman, M. Organoids – New models for host-helminth interactions. Trends in Parasitology. 36 (2), 170-181 (2020).
- Kar, S. K., et al. Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research. Veterinary Research. 52 (1), 43 (2021).
- Hamilton, C. A., et al. Development of in vitro enteroids derived from bovine small intestinal crypts. Veterinary Research. 49 (1), 54 (2018).
- Beaumont, M., et al. Intestinal organoids in farm animals. Veterinary Research. 52 (1), 33 (2021).
- Lee, B. R., et al. Robust three-dimensional (3D) expansion of bovine intestinal organoids: An in vitro model as a potential alternative to an in vivo system. Animals (Basel). 11 (7), 2115 (2021).
- Töpfer, E., et al. Bovine colon organoids: From 3D bioprinting to cryopreserved multi-well screening platforms. Toxicology in Vitro. 61, 104606 (2019).
- Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
- Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).
- Rusu, D., Loret, S., Peulen, O., Mainil, J., Dandrifosse, G. Immunochemical, biomolecular and biochemical characterization of bovine epithelial intestinal primocultures. BMC Cell Biology. 6, 42 (2005).
- Dibb-Fuller, M. P., Best, A., Stagg, D. A., Cooley, W. A., Woodward, M. J. An in-vitro model for studying the interaction of Escherichia coli O157:H7 and other enteropathogens with bovine primary cell cultures. Journal of Medical Microbiology. 50 (9), 759-769 (2001).
- Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers. Veterinary Research. 53 (1), 15 (2022).
- Barrila, J., et al. Modeling host-pathogen interactions in the context of the microenvironment: Three-dimensional cell culture comes of age. Infection and Immunity. 86 (11), e00282-e00318 (2018).
- Carvalho, P. H. V., Pinto, A. C. J., Millen, D. D., Felix, T. L. Effect of cattle breed and basal diet on digestibility, rumen bacterial communities, and eating and rumination activity. Journal of Animal Science. 98 (5), skaa114 (2020).
- Thorne, C. A., et al. Enteroid monolayers reveal an autonomous WNT and BMP circuit controlling intestinal epithelial growth and organization. Developmental Cell. 44 (5), 624-633 (2018).
