生成用于转化生物医学研究的牛原代肠源二维单层培养系统

所有协议均按照机构和国家动物福利指南和法规执行。 1.试剂制备 注：本研究中使用的试剂的原液和最终浓度列于 表1中。 准备样品采集缓冲液：混合 1 L 含有青霉素 （100 U/mL）、链霉素 （100 μg/mL）、庆大霉素 （25 μg/mL） 和卡泊芬净 （2.5 μg/mL） 的冰冷磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。将储备溶液储存在4°C。 制备解离试剂 #1：混合 18.55 mL 样品采集缓冲液（如步骤 1.1 所述）、1.422 mL 乙二胺四乙酸（EDTA，0.422 M/pH 7.4）、20 μL 1 M 1,4-二硫苏糖醇 （DTT） 溶液、4 μL Y-27632 溶液 （5000x/50 mM）。将溶液储存在4°C。 制备解离试剂 #2：混合 18.57 mL 收集缓冲液（如步骤 1.1 所述）、1.422 mL EDTA （0.422 M/pH 7.4）、4 μL Y-27632 溶液 （5000x/50 mM）。将溶液储存在37°C。 制备肠生长培养基储备液：混合 9.875 mL 类器官生长培养基加补充剂、100 μL 青霉素 （100 U/mL）、链霉素 （100 μg/mL）、5 μL 庆大霉素 （25 μg/mL） 和 20 μL 卡泊芬净 （2.5 μg/mL）。将溶液储存在4°C。 制备肠样分化培养基储备液：混合 10 mL 类器官分化培养基和补充剂、100 μL 青霉素 （100 U/mL）、链霉素 （100 μg/mL）、5 μL 庆大霉素 （25 μg/mL） 和 20 μL 卡泊芬净 （2.5 μg/mL）。将溶液储存在-20°C。 准备洗涤介质：混合 48.45 mL DMEM/F-12 1.1 培养基（含 L-谷氨酰胺，不含 HEPES）、1 mL 不含维生素 A 的 B-27 添加剂（50x 原液）、500 μL 青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 μg/mL）、25 μL 庆大霉素（50 mg/mL 原液）和 25 μL 卡泊芬净（5 mg/mL 原液）。将溶液储存在4°C。 准备包衣缓冲液：混合 25 mL DMEM：不含抑制剂的 F12 完全培养基和 25 mg 牛血清白蛋白 （BSA）。将溶液储存在4°C。 2.从整个组织中分离肠隐窝（图1） 注：牛小肠类肠是由当地牛肉加工厂的健康成年荷斯坦牛（>2岁）的回肠组织产生的。这一系列实验使用了一名供体。 肠道组织样本的制备将收获的 ~10 英寸（25 厘米）肠道组织样品放入 ~400 mL 冰冷收集缓冲液（PBS + 抗生素/抗真菌剂）中，并放在冰上，以便运输到实验室。 使用手术剪刀（例如蛋黄酱剪刀）和镊子（例如艾德森镊子），从肠道组织样本中去除多余的脂肪和肠系膜。 将纸巾切成两等份。 用手术剪刀纵向打开组织，并在无菌PBS中冲洗组织。 使用无菌玻璃显微镜载玻片的侧面轻轻去除肠道样本的粘液层，并用新鲜的PBS冲洗组织。注意：此步骤有助于去除绒毛，并有助于在后续步骤中提高隐窝部分的纯度。 对于每个 5 英寸（13 厘米）的碎片，将组织切成两个 2.5 英寸（6.5 厘米），然后将每个碎片切成 4 个大致相等的小块，以促进组织解离。 肠道组织的解离在无菌的 50 mL 锥形管中制备 20 mL 体积的组织解离试剂 #1，并将小组织样品沉积到锥形管中，直到体积位移将半月面从 20 mL 标记移动到锥形管上的 35 mL 标记。 对剩余的小肠组织样品片重复上述步骤。 用石蜡膜密封锥形管，手动摇晃锥形管10次。注意：在整个协议中，手动摇晃应以深思熟虑但轻柔的方式进行。 将锥形管水平放置在轨道振荡平台上的容器中的冰上。 在容器中的冰上以每分钟80转（rpm）摇晃锥形管30分钟。每 10 分钟手动摇晃锥形管。 在 50 mL 锥形管中制备 20 mL 体积的预热 （37 °C） 组织解离试剂 #2（如上配制，但不含 DTT）。将含有解离试剂 #1 的锥形管中的组织样品沉积到含有解离试剂 #2 的锥形管中。 用封口膜密封锥形管，手动摇晃锥形管10次。 将锥形管放入预热（37°C）振荡水浴中，以约60°C的角度倾斜，并以150rpm振荡10分钟，5分钟后手动振荡，在总孵育10分钟后再次振荡。 隔离地穴碎片标记 10 个无菌锥形管 #1 – #10。向每个标记的锥形管中加入 20 mL 无菌冰冷 PBS。 将组织块从含有解离试剂 #2 的锥形管转移到含有冰冷 PBS #1 的新型无菌 50 mL 锥形管中。 手动摇晃锥形管 10 次。 用封口膜密封锥形管，并将它们水平放在冰上。在轨道振荡器上以80rpm摇动锥形管10分钟。10分钟后，手动摇晃锥形管#1 10次。这被认为是 Wash #1。 使用一对手术镊子将组织样本轻轻转移到锥形管 #2 中。 重复步骤 2.3.2 – 2.3.4，这被视为 Wash #2。 重复洗涤，直到洗涤 #10。 每次洗涤的上清液都含有将用于类肠生成的隐窝。将含有上清液的试管保持在4°C，直到所有10洗涤完成。 在第10洗 涤完成并弃去组织切片后，将锥形管#6-#10的上清液在4°C下以400× g 离心2分钟，以沉淀分离的隐窝。注意：洗涤液 6-10 包含最干净的完整隐窝部分，碎片和单细胞有限。因此，建议仅将这些馏分用于类肠生成，并丢弃较早的洗涤液（#2-#5） 弃去上清液，将 4 mL 新鲜冰冷的 PBS 加入隐窝中，无需重悬（这有助于在显微镜检查之前保持片段完整）。 通过显微镜检查每个锥形管#6-#10的解离隐窝的纯度。向 384 孔板中加入 50 μL PBS。 向 PBS 中加入 10 μL 隐窝悬浮液，并使用 40 倍放大倍率物镜测定隐窝纯度、完整性和计数。注意： 在板的底部画一个十字井可以使计数更容易。 3.牛回肠类肠的 离体 产生和传代（图2） 注意：来自具有最纯净、完整肠隐窝的锥形管的隐窝将用于下游测定。对于涉及隐窝和类肠的所有步骤，移液器吸头、细胞刮刀和试管必须预先涂有包衣缓冲液，并应避免气泡以防止隐窝丢失。除非另有说明，否则应使用 1000 μL 移液器吸头来防止隐窝碎片破裂。 从隐窝碎片生成类肠将最纯净的隐窝部分（通常为#6-#10）组合成一个锥形管。 在4°C下以400× g 离心含有隐窝的锥形管2分钟。 用移液管吸出上清液，弃去上清液，并将隐窝沉淀重悬于洗涤介质中。 离心机如步骤3.1.2所示。倒出上清液，并向隐窝沉淀中加入 2 mL 洗涤培养基。 按照步骤 2.3.11.1 中所述计算密码的数量。 如步骤3.1.2中离心，沉淀隐窝，弃去上清液，并重悬于冰冷的100%还原生长因子基底膜细胞外基质（BME）中，以达到约400个隐窝/ 100μL的浓度。注意：重要的是在4°C下正确解冻BME，因为温度变化会改变其稠度。使用冷却块和预冷的移液器吸头可以防止BME过早固化。在创建圆顶时，使用另一种基底膜基质配方可能需要稀释 BME。请参阅特定于所用 BME 的制造商说明。 上下移液以彻底悬浮 BME 中的隐窝。 通过将 50 μL 隐窝 BME 悬浮液缓慢移液到设置为 37 °C 且最多 8 个圆顶/孔的加热板上的 6 孔组织培养板上，制备隐窝 BME 圆顶。注意：在铺覆圆顶之前，必须在37°C的培养箱中预热6孔板过夜。 将6孔板保持在加热板上1分钟，然后小心地将板移至37°C，5%CO2 培养箱中。 2分钟后，翻转6孔板，使盖子朝下，再孵育30分钟，使圆顶聚合。 30 分钟后，小心地将 3 mL 补充有 10 μM SB202190、0.5 μM LY2157299和 10 μM Y-27632 的室温 （RT） 类肠生长培养基加入含有圆顶的孔中。 在37°C，5%CO2孵育。 取出培养基，每 2-3 天更换一次补充有抑制剂的新鲜类肠生长培养基。 类肠的传代7-10天后，确保隐窝已形成具有许多出芽结构的3D肠状体，如 图2E所示，并准备好通过。 从包含圆顶的孔中丢弃介质。 每孔每 4 个圆顶，向每个含有圆顶的孔中加入 1 mL 补充有 10 μM Y-27632 的冰冷非酶细胞解离溶液。 使用预包被的细胞刮刀，轻轻地将圆顶从组织培养板上取下。 在 15 mL 锥形管中收集类肠溶物，并通过上下移液 10 次进行研磨。 将含有碎裂肠样的锥形管在室温下以80rpm在轨道振荡器上孵育10分钟。 向类肠中加入 10 mL 含有 10 μM Y -27632 的冰冷洗涤培养基。 在室温下以300× g 离心锥形管5分钟。 弃去上清液，将沉淀重悬于10 mL新鲜洗涤培养基中，然后转移到新的15 mL锥形管中。 在室温下以300× g 离心锥形管5分钟。 弃去上清液，将沉淀重悬于1.5 mL微量离心管中的1 mL类肠生长培养基中。 在室温下以300× g 离心微量离心管5分钟，弃去上清液。 将肠样沉淀重悬于冰冷的100%BME中，并按照步骤3.1.6-3.1.13进行操作。 每 7 天重新传代一次肠样。扩增时间可能因出芽的密度、活力和程度而异。形成大肠样结构的多个出芽结构表明类肠需要传代。 类肠动物的冷冻保存对于冷冻保存，确保类肠在培养物中的传代次数不超过五次。注意：这尚未经过实验测试，并且基于作者的观察，即后来的段落降低了活力并产生了可变的结果。 要收获类肠，请使用步骤3.2.2-3.2.9中所述的解离缓冲液。注意：使用 5 mL 移液管机械解离类肠溶液。 按照步骤2.3.11.1中所述计算类肠片段的数量。 在室温下以300× g 离心锥形管5分钟。 弃去上清液并将类肠片段重悬于补充有 10 μM Y-27632 的冻存培养基中，以达到 ~2000 个类肠片段/mL 的浓度，并将 1 mL 等分到预标记的冷冻管中。 将冻存管放入受控冷冻容器中，并在-80°C下储存过夜。 将冷冻管转移到气相液氮中进行长期储存。 肠隐窝碎片的复苏将 6 孔板放在培养箱内过夜。 用 5 mL 包衣介质预涂 5 mL 试管。 从液氮储存中取出冷冻管。 解冻后，立即将隐窝从冷冻管转移到预包被的 5 mL 管中。用洗涤介质冲洗出冷冻管，然后加入 5 mL 试管中。避免气泡。 用洗涤介质将体积提高到5mL，并在4°C下以400× g 离心5分钟。 在离心过程中，用包衣介质预涂 1.5 mL 试管。 离心后，倒出上清液，将沉淀重悬于管中剩余的培养基中，并转移到预包被的 1.5 mL 管中。用洗涤介质洗涤 5 mL 试管并将其转移到 1.5 mL 试管中。在4°C下以400× g 离心5分钟。 使用类肠生长培养基将体积增至 1.5 mL。 如上所述离心（步骤3.4.7），并小心吸气。 从4°C取BME并放在冰/冰块上。 将肠样沉淀重悬于冰冷的100%BME中，并按照步骤3.1.6-3.1.12进行操作。 每 2-3 天更换一次介质。 4. 从 3D 类肠生成和评估 2D 单层 注意：如上所述，对于涉及隐窝和类肠的所有步骤，移液器吸头、细胞刮刀和试管应预先涂有涂层缓冲液，并应避免气泡以防止隐窝丢失。 用于二维单层形成的transwell插入物的制备将插入物放入 24 孔组织培养适配器板中，并在肠生长培养基中用 100 μL 1：15 稀释的 BME 预涂 1 μm PET 24 孔细胞培养插入物的顶端。在进行屏障完整性测量时，始终涂覆一个额外的插件，该插件将用作对照。 将包被的插入物放入培养箱中的24孔组织培养适配器板中。注意：特定的适配器或伴随组织培养板必须与transwell插件一起使用。 将培养插入物在37°C，5%CO2 下孵育1小时以允许聚合。注意：BME涂层的transwell可以用封口膜密封，如果不立即使用，可以在4°C下储存长达1周。 在孵育结束时，吸出3D肠培养基。 3D类肠溶解从冻存的类肠片段中生成 2D 类肠单层，这些片段按照上述第 3.1 节所述进行复苏、铺板和培养以形成 3D 类肠。将解冻的类肠菌传代至少两次，最后一次传代至少培养 5 天，然后再处理以产生 2D 单层培养物。 通过向肠穹顶中加入补充有 10 μM Y-27632 的冰冷洗涤培养基来收获肠样（4 个穹顶使用约 1 mL 解离缓冲液） 用细胞刮刀拆下圆顶，并将其收集到 15 mL 锥形管中。 使用 1 mL 移液器吸头研磨 30 次以生成类肠片段。 用 200 μL 移液器吸头研磨 40 次，以进一步分解类肠碎片。 用冰冷的洗涤培养基将含有肠样碎片的 15 mL 锥形管的体积降至 10 mL。 在室温下以300× g 离心锥形管5分钟。 吸出上清液，包括BME层，注意不要干扰肠样沉淀。注意：BME层将显示为颗粒上方的浑浊凝胶状层。 对于每 4 个圆顶，将沉淀重悬于补充有 10 μM Y-27632 的预热 TrypLE 表达酶的 1 mL 中。 将肠溶-TrypLE混合物加入24孔板中，并在37°C，5%CO2 孵育10分钟。 10分钟后，使用1mL移液管移取肠溶液-TrypLE混合物40次，以进一步碎裂肠溶液。 然后，用 200 μL 移液管将碎片碎片化 40 次，将碎片分解成单个细胞。 使用连接无菌 22-G 针头的 3 mL 或 5 mL 注射器，抽吸并分配细胞悬液 4 次，以获得单细胞悬浮液。 如步骤2.3.11.1所述，通过显微镜监测细胞解离，直到80%的类肠分解成单个细胞。 将细胞悬液收集到 15 mL 锥形管中，加入补充有 10% FBS 的 4 倍体积洗涤培养基，淬灭酶促反应。 通过预包被的 40 μm 细胞过滤器两次过滤肠道，进入 50 mL 锥形管中。 通过将锥形管以300× g 离心5分钟来沉淀单细胞。 transwell 插入物上的 2D 单层接种。倒出上清液，并将沉淀重悬于小体积（~600μL）类器官生长培养基中，并在室温下补充有20%胎牛血清（FBS）。 使用台盼蓝染料排阻法、血细胞计数器或自动细胞计数仪测定肠样细胞密度和活力。预计平均存活率为 75%。 在接种细胞之前，小心地从细胞培养插入物中除去步骤1.3中应用的多余包被溶液。 将单个细胞以 1 x 105 个细胞的体积接种在预包被的细胞培养插入物的顶端表面上，每个插入片段的体积为 200 μL。 向细胞培养插入页的基底外侧加入 700 μL 补充有 20% FBS 的完全培养基。 以数字 10 的形状操纵板 8 次，以使细胞均匀地分布在插入物上。 在生物安全柜中将板放在盘子上加热 10 分钟。 将板在37°C和5%CO2下孵育。 48小时后，用补充有20S和抑制剂的新鲜肠生长培养基替换顶端和基底隔室上的培养基。 在第三天，从顶端和基底外侧隔室中取出培养基，用1x PBS仔细洗涤插入物，并用仅补充有抑制剂的肠分化培养基代替。 每 2-3 天更换一次两个隔间中的介质。 上皮屏障完整性和单层汇合度的定量测量注意：可以通过使用上皮伏尔表测量跨上皮电阻 （TEER） 来评估屏障完整性。从培养箱中取出transwell培养板，使其在生物安全柜中在室温下平衡几分钟。 确保 STX2 电极已按照制造商的说明进行预处理并将伏赫表校准为 1000Ω。 将探针的长棒插入基底外侧隔室，将短端插入跨孔上皮细胞培养物的顶端隔室。注意不要破坏单层或损坏嵌件。 稳定后，记录每个跨孔插入点的 3 次 TEER 测量值，包括不带细胞的插入点。取每个刀片的平均测量值。 通过从实验孔的平均测量值中减去空白孔的平均测量值，然后将其乘以插入物的表面积以确定上皮屏障的阻力（TEER [Ω.cm 2] = [Rcell layer – Rblank] × Area）来计算校正后的 TEER 值。