Enteroider fremstår som en ny model til undersøgelse af vævsfysiologi og patofysiologi, lægemiddeludvikling og regenerativ medicin. Her beskriver vi et bovin primærcelle 2D enteroidafledt kultursystem, der tillader samdyrkning med relevante vævscelletyper. Denne model giver en translationel fordel for gastrointestinal forskningsmodellering.
Organoide cellekultursystemer kan rekapitulere kompleksiteten observeret i væv, hvilket gør dem nyttige til at studere værtspatogeninteraktioner, evaluere lægemiddeleffektivitet og toksicitet og vævsbioteknologi. Anvendelse af disse modeller af de beskrevne årsager kan dog være begrænset på grund af disse modellers tredimensionelle (3D) karakter. For eksempel er det udfordrende at bruge 3D enteroidkultursystemer til at studere fordøjelsessygdomme på grund af utilgængeligheden af tarmlumen og dets udskillede stoffer. Faktisk kræver stimulering af 3D-organoider med patogener enten luminal mikroinjektion, mekanisk forstyrrelse af 3D-strukturen eller generering af apikale enteroider. Desuden kan disse organoider ikke dyrkes sammen med immun- og stromale celler, hvilket begrænser dybtgående mekanistisk analyse af patofysiologisk dynamik. For at omgå dette optimerede vi et bovin primærcelle todimensionelt (2D) enteroidafledt monolagskultursystem, der tillader samdyrkning med andre relevante celletyper. Ileal krypter isoleret fra raske voksne kvæg blev dyrket for at generere 3D organoider, der blev kryopræserveret til fremtidig brug. Et 2D-monolag blev skabt ved hjælp af genoplivede 3D-enteroider, der blev passeret og forstyrret for at give enkeltceller, som blev podet på kældermembranekstraktbelagte transwellcellekulturindsatser og derved udsatte deres apikale overflade. Den intestinale monolagspolaritet, cellulære differentiering og barrierefunktion blev karakteriseret ved anvendelse af immunofluorescensmikroskopi og måling af transepitelial elektrisk modstand. Stimulering af monolagets apikale overflade afslørede monolagets forventede funktionalitet, som demonstreret ved cytokinsekretion fra både apikale og basale rum. Den beskrevne 2D enteroidafledte monolagsmodel har et stort løfte om at undersøge værtspatogeninteraktioner og tarmfysiologi, lægemiddeludvikling og regenerativ medicin.
Dyremodeller i forskning spiller en afgørende rolle i at øge vores forståelse af sygdomspatofysiologi og dynamikken i værtsimmunresponset under infektion og understøtter udviklingen af nye forebyggende og terapeutiske strategier 1,2,3,4. Disse modeller understøtter forskning, opdagelse og fremskridt inden for dyr og er nøglen til fremskridt inden for forskning i menneskers sundhed. I årtier har gnavermodeller understøttet fremskridt inden for immunmekanismer og grundlæggende biologisk forskning for menneskelige sygdomme 3,5,6,7. Mens gnavermodeller er kritiske i screening og tidlig udviklingsforskning, tilbyder store dyremodeller en mere relevant sammenligning i forskning i menneskelige sygdomme i både tidlige opdagelser og senere udviklingsundersøgelser, herunder terapeutisk effekt og sikkerhedstest 1,3,4,5. Husdyr giver klare fordele sammenlignet med gnavermodeller for mere effektiv oversættelse til humane applikationer til nogle sygdomme, herunder kryptosporidiose, salmonellose, tuberkulose, respiratorisk syncytialvirus og brucellose 1,7,8. Faktisk udvikler disse sygdomme og andre spontant hos kvæg, som deler flere analoge sygdomspatogenese og immunprocesser med mennesker, og som en udavlet befolkning efterligner kvæg den genetiske og miljømæssige heterogenitet, der påvirker humane immunresponser 5,8,9,10 . Fordelene ved kvægmodeller til forskning i infektionssygdomme kan maksimeres ved først at anvende et sofistikeret kultursystem og derefter implementere in vivo-undersøgelser trinvist. Den første anvendelse af et meget komplekst dyrkningssystem afledt af kvæg kan reducere antallet af dyreforsøg betydeligt og samtidig forbedre chancerne for vellykket translationel og anvendt forskning. Dyrkningsmodeller bør rekapitulere sygdomsprocesserne på organniveau for optimal prædiktiv validitet, idet det oprindelige vævsmikromiljø bevares rumligt og funktionelt.
Det slimhindeimmunrespons er et mangefacetteret system, der består af en yderst effektiv barriere dannet af gastrointestinale enterocytter og forskellige populationer af immunceller placeret under slimhindeoverfladen11. Dette meget komplekse system er kritisk under infektion for at opretholde GI-homeostase og initiere immunforsvar mod enteriske patogener11. Kommunikation mellem enterocytter og underliggende medfødte immunceller initierer udviklingen af beskyttende immunresponser mod patogene mikroorganismer. Som sådan er dyrkningssystemer, der er komparative i deres kompleksitetsniveau, nødvendige for en optimal undersøgelse af vært-enteriske patogeninteraktioner og er yderst effektive til forståelse af enterisk fysiologi og lægemiddelopdagelse og -udvikling12,13. Organoider er et robust kultursystem, der ligner arkitekturen og funktionen af oprindelsesvævet14,15. Multicellulariteten af disse modeller tillader undersøgelse af forskellige cellepopulationers rolle og de cellulære interaktioner, der er involveret i enterisk sundhed og sygdom12,14. Imidlertid er humanafledte organoidmodeller i forskning i øjeblikket begrænset af vanskeligheden ved at opnå en tilstrækkelig mængde og ensartet kvalitet af humane tarmepitelceller og begrænset cellelevedygtighed i kultur. Udødeliggjorte cellelinjer kan bruges til konsekvent at opnå høje udbytter af homologe kulturer i disse modeller; Imidlertid mangler transformerede celler i sagens natur mangfoldigheden og den funktionelle kompleksitet af ikke-transformerede epitelceller 16,17. Fordelene ved at bruge kulturer afledt af kvægvæv som model til undersøgelse af gastrointestinale sygdomme og fysiologi omfatter den lethed, hvormed vævsprøver konsekvent kan opnås fra raske donorer, forbedret cellelevedygtighed og større cellulær mangfoldighed, der kun kan opnås med ikke-udødeliggjort væv. Sammenlignende vævstranskriptomik og karakterisering af tarmorganoider afslører ligheder i bevarede ortologe gener og cellulære potentialer mellem mennesker og kvæg18. Derfor kan et dyrkningssystem afledt af kvægorganoider være et fordelagtigt til undersøgelse af tarmsygdomme hos mennesker, hvor resultaterne let kan overføres til humanmedicin.
Protokollen beskrevet heri beskriver en effektiv platform til evaluering af værtsresponser på enteriske patogener eller forbindelser og tarmfysiologi ved hjælp af et bovin enteroidafledt 2D primærcellekultursystem. I modsætning til 3D-organoider tillader 2D-kultursystemer genereret på transwellindsatser en dobbelt kultur af tarmceller med immun- eller stromale celler, hvilket muliggør undersøgelse af vævsniveaudynamikken. Med anvendelser inden for biomedicinsk forskning, farmaceutisk udvikling og effektivitetstest kan denne fysiologisk relevante model gavne både kvægs og menneskers sundhed og fremskridt.
Protokollen præsenteret her beskriver en fysiologisk relevant model til undersøgelse af tarmfysiologi og enteriske lidelser. Flere forskergrupper har beskrevet dannelsen af kvægenteroidkulturer, herunder 2D-monolag 16,19,20,21,22,23,24. Mens generering af monolag ikke er åbenlyst teknisk udfordrende, er flere minutters trin afgørende for at udvikle succesrige kulturer konsekvent. Som sådan kan reproducerbarheden af 2D-monolag ved hjælp af de kort beskrevne metoder i den offentliggjorte litteratur være udfordrende for en forsker, der er nybegynder inden for organoider, at foretage. Den protokol, der er beskrevet heri, er tilpasset fra disse protokoller og dem, der er offentliggjort i andre arter, og giver en trinvis vejledning til generering af monolag på transwellskær, der er meget reproducerbar.
Den protokol, der er skitseret heri, kan let ændres, så den passer til de specifikke mål for det eksperimentelle design eller tilgængeligheden af reagenser. Efter denne protokol kan vellykkede kulturer opnås ved såning af monolag ved en lavere celletæthed (f.eks. 2,5 x 104) eller i fravær af FBS, som beskrevet i andre publikationer24. Ændring af disse parametre kan dog kræve en øget kultur for at etablere et sammenflydende monolag. Som sådan, hvis andre faktorer, der er integreret i undersøgelsesdesignet, herunder co-kultur med immunceller, dikterer et bestemt tidsforløb for eksperimentet, kan såtætheden ændres efter behov. Mens andre kældermembranformuleringer kan erstattes i stedet for den, der anvendes i denne protokol til at generere 3D-enteroider og 2D-monolag, vil disse kræve en vis optimering for at bestemme det optimale kældermembran-til-medie-forhold.
Anvendelsen af transwellindsatser i den beskrevne metode har mange fordele i forhold til monolagsvækst på konventionelle plastvarer og 3D-enteroidkulturer. Sammenlignet med standard vævskulturplader fremmer brug af transwells til enkeltlagskulturer cellulær differentiering og organisering på en måde, der bevarer lighed med tarmkrypter14,25. Den intestinale epitelbarriere er afgørende for at forhindre translokation af toksiner og mikroorganismer i kroppen, samtidig med at næringsstofabsorptionen lettes. Som sådan er det afgørende at forstå, hvordan tarmens barriereintegritet fungerer sundt og ændres under tarmlidelser eller som reaktion på forbindelser. I modsætning til 3D enteroidkulturer er objektiv vurdering af tarmbarriereintegritet mulig ved kombination af monolag på transwells og måling af TEER, som demonstreret heri14,25. Generering af 2D-monolag på transwells tillader også dobbeltkultur med relevante celletyper såsom immun- eller stromale celler. Dette gør det muligt at karakterisere kritisk vigtig krydstale mellem tarmceller og celler i vævsmikromiljøet, hvilket ikke kan opnås med 3D-kulturer. Eksponering af monolagets apikale overflade muliggør ikke blot eksperimentel eksponering for patogener og forbindelser og indsamling af luminale produkter, men giver også mulighed for undersøgelser af andre aspekter af tarmfysiologi og -sygdomme, herunder undersøgelse af tarmmikrobiota og molekylær absorption eller transportfysiologi13. Uafhængig kontrol over de apikale og basale tarmoverflader er en klar fordel i forhold til 3D enteroidmodeller.
Gennem flere forsøgseksperimenter identificerede vi vigtige trin, der bidrog til protokollens succes. Mens prøver af heltarmsvæv kan nedkøles natten over og behandles den følgende dag, skal vævsdissociationen og isoleringen af kryptfragmenttrin udføres straks for at forhindre opløsning af de isolerede kryptfraktioner. Når PBS-vaskerne er afsluttet, kan centrifugering af krypterne i vaskemedier hjælpe med at forhindre kryptnedbrud, som beskrevet i trin 2.3.10. Når man passerer enteroiderne eller høster dem til enkeltlagsdannelse, er det vigtigt at adskille enteroiderne fra BME-kuplerne. Vaskemediet skal være iskoldt for at hjælpe med at opløse BME. I modsætning, ved hjælp af forvarmet TrypLE og filtrering af cellesuspensionen to gange kan hjælpe med at danne de enkelte celler, der er nødvendige for monolagsgenerering. Endelig kan manuel manøvrering af pladen i form af tallet 8 hjælpe med at sprede de enkelte celler jævnt over transwellindsatsen.
En vigtig begrænsning ved denne protokol er, at 2D-monolagene blev fremstillet af enteroidstammer genereret fra en moden Holstein-stud (>2 år). Den modne mave-tarmkanal hos kalve kan nødvendiggøre mindre ændringer af den beskrevne protokol for at give optimale resultater. Racespecifikke forskelle i tarmfysiologien hos kvægracer er beskrevet i litteraturen26. Selvom det er ukendt, om disse forskelle kan påvirke enteroid og efterfølgende monolagsgenerering, formoder vi, at eventuelle forskelle kun vil resultere i mindre ændringer i vores protokol. Derudover har 2D-kulturmodellen nogle iboende ulemper. Sammenlignet med 3D-enteroidmodeller kan 2D-kulturer mangle nogle aspekter af tarmvævsarkitekturen og cellulær mangfoldighed og skabe begrænsninger og udfordringer forbundet med udbredelsen af 2D-kultur13. Alligevel viser undersøgelser, at nogle monolag kan efterligne forventet kryptorganisation27, og nogle af disse begrænsninger kan endda overvindes ved at etablere 2D-kulturer med en luft-væske-grænseflade. Ikke desto mindre bør begrænsningerne i denne model overvejes fuldt ud for at afgøre, om dens anvendelse er egnet til det eksperimentelle spørgsmål, der stilles.
Denne protokol beskriver et optimeret dyrkningssystem, der modellerer mavetarmkanalen hos kvæg ved hjælp af enteroider afledt af bovin ileum til dannelse af monolag på transwellindsatser. Med en bred vifte af anvendelser fra forskning i infektionssygdomme til lægemiddelopdagelse og regenerativ medicin kan dette dyrkningssystem med høj kapacitet føre til en hidtil uset udvikling af forebyggende og terapeutiske strategier, der kan være gensidigt gavnlige for dyrs og menneskers sundhed.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender brugen af Cellular and Molecular Core Facility ved Midwestern University.
0.2 mL pipette tip | MidSci | PR-200RK-S | |
1 µm PET 24-well cell culture inserts | Corning | 353104 | |
1000 mL pipette tip | MidSci | PR-1250RK-S | |
22 G needle | Becton, Dickinson and Company | 305156 | |
24-well culture vessel | Corning | 353504 | |
40 μm cell strainer | Corning | 431750 | |
50 mL centrifuge tube | Fisher scientific | 14-955-240 | |
5-mL pipet tip | Fisher scientific | 30075307 | |
5 mL syringe | Becton, Dickinson and Company | 309647 | |
5 mL tube | Eppendorf | 30119401 | |
Anti-Cytokeratin -18 (C-04) | Abcam | AB668-1001 | |
B-27 supplement without vitamin A | Gibco | 12-587-010 | |
Belysa software | Luminex | 40-122 | Immunoassay curve fitting software |
Bovine serum albumin (BSA) | Fisher bioreagents | BP9704-100 | |
Caspofungin acetate | Selleckchem | S3073 | |
Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
Chromogranin-A (E-5) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271738 | |
Coverslips | Fisher scientific | 12-540-C | |
Cryovials | Neptune scientific | 3471.X | |
Cultrex Ultimatrix RGF BME | R&D Systems | BME001-05 | |
DAPI | MilliporeSigma | D9542-5MG | |
Dissecting scissors | VWR | 82027-588 | |
Dithiothreitol (DTT) solution | Thermo Scientific | FERR0861 | |
DMEM/ F-12 1.1 medium (with L-glutamine, without HEPES) | Cytiva | SH30271.01 | |
E-cadherin | Cell Signaling Technology | #3195 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher Scientific | BP2482500 | |
FBS | Corning | MT35070CV | |
Gentamicin | Gibco | 15710064 | |
Glass microscope slide | Fisher scientific | 12-550-07 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
Hemacytometer | Bio-Rad | 1450015 | |
IntestiCult organoid Differentiation medium (Human) | StemCell Technologies | 100-0214 | |
IntestiCult organoid growth medium (Human) | StemCell Technologies | 0-6010 | |
Keyence BZ-X700 | Keyence | BZ-X700 | |
LY2157299 (Galunisertib) | Selleckchem | S2230 | |
MAGPIX system | Luminex | Magpix system | Compact multiplexing unit |
Microscope | Keyence | BZ-X700 | |
MILLIPLEX Bovine Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel | MilliporeSigma | BCYT1-33K | Bead-based multiplex assay |
Mr. Frosty container | Nalgene | 5100-0001 | |
Non-Enzymatic Cell Dissociation Solution | ATCC | 30-2103 | |
NutriFreeze D10 Cryopreservation Media | Biological Industries | 05-713-1B | |
Orbital shaking platform | Thermo Fisher | 88880021 | |
Pam3Csk4 | invivogen | tlrl-pms | |
Parafilm sealing film | dot scientific inc. | #HS234526C | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Phalloidin-FITC | R&D Systems | 5782/12U | |
Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-20 | |
Prolong Glass Antifade | Invitrogen | P36982 | |
Rabbit anti-human Lyzozyme (EC3.2.1.17) | Agilent technologies | A009902-2 | |
SB202190 (FHPI) | Selleckchem | S1077 | |
Shaking water bath | Thermo Fisher | MaxQ 7000 | |
Sodium Azide | VWR | BDH7465-2 | |
Streptomycin | Teknova | S6525 | |
Trypan Blue dye | Gibco | 15250-061 | |
TrypLE express enzyme | Life technologies | 12604013 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | |
Voltohmmeter | MilliporeSigma | Millicell ERS-2 | |
Y-27632 | Selleckchem | S1049 |